[发明专利]一种用于hPPARγ配体药物筛选细胞模型的方法

权利要求书

1. 一种用于hPPARγ配体药物筛选细胞模型的方法，其特征在于：它包括以下步骤：

第一，用含质量分数为10% FBS的HG-DMEM培养基培养293T细胞，选择其生长旺盛的时期，按8×10⁴/孔的密度种24孔板；

第二，待细胞汇集至90~95%时，采用Lipofectamine 2000将重组质粒phPPARγ-IRES2-EGFP、报告质粒ptk-PPRE×3-luc和内部对照质粒pRL-CMV按100:50:1的比例共转染239T细胞，并同时设立空载体pIRES2-EGFP对照组；转染36h 后检测转染效率和绿色荧光蛋白GFP的表达情况；

第三，hPPARγ特异性配体阳性药物罗格列酮干预；293T细胞培养和质粒共转染同第一、二方法；转染14 h后，更换新鲜的含质量分数为10% FBS的HG-DMEM培养基，将不同浓度的阳性药物罗格列酮加入到各自的转染培养体系中，药物浓度设置为1‰ DMSO、10^-8 mol/L、10^-7 mol/L、10^-6 mol/L、10^-5 mol/L和10^-4 mol/L，作为量-效分析研究；同时采用10^-5 mol/L浓度罗格列酮，加入到各自的转染培养体系中，并于8 h、16 h、24 h、36 h 和48 h进行时-效分析；

第四，对上述共转染239T细胞反应体系更换干预药物，采用PPARα特异性配体WY14643，用以检测、确定人工模拟hPPARγ信号通路的细胞模型反应特异性；

第五，采用相同浓度序列的全反式维甲酸代替PPARγ阳性药物罗格列酮，对上述3反应体系进行干预，以了解上述体系是否可通过全反式维甲酸激动。

2.根据权利要求1所述的用于hPPARγ配体药物筛选细胞模型的方法，其特征在于：第三至第五步骤均采用双荧光素酶报告基因检测法分别检测萤火虫荧光素酶发光值和内部对照海肾荧光素酶发光值，根据酶比值所得数值分析该模型的可行性。

3.根据权利要求1所述的用于hPPARγ配体药物细胞模型的方法，其特征在于：第二步骤中的重组质粒phPPARγ-IRES2-EGFP、报告质粒ptk-PPRE×3-luc和内部对照质粒pRL-CMV的比例为0.5μg: 0.25μg:0.005μg。