[发明专利]一种检测猪葡萄球菌脱落毒素抗体的ELISA方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种ELISA方法，特别涉及一种检测猪葡萄球菌脱落毒素抗体的ELISA方法。

背景技术

葡萄球菌产生的脱落毒素可以引起人和动物发生严重的皮肤性疾病。例如金黄色葡萄球菌可引起人的烫伤样皮肤综合症，猪葡萄球菌可引起仔猪发生渗出性皮炎。目前发现的脱落毒素有8种，包括金黄色葡萄球菌产生的ETA、ETB和ETD，以及猪葡萄球菌产生的EXHA、EXHB、EXHC和EXHD、SHETA、SHETB。

猪葡萄球菌S.hyicus可以引起猪群发生大规模的渗出性皮炎病(Exudative Epidermitis，EE)，它是一种急性、高度接触性的猪传染病，患猪以急性全身性渗出性皮炎为主要特征，该病又称溢脂性皮炎或煤烟病。本病主要感染5-6日龄的初生哺乳仔猪、刚断奶的仔猪以及母猪乳房上。该病原可通过各种途径感染，主要以破裂和损伤的皮肤黏膜引起动物的感染。据国内外的研究结果表明它的发病率为80％；死亡率5％～90％不等；少数存活的病猪常导致生长发育障碍形成“僵猪”。猪葡萄球菌首先在丹麦被研究人员发现，到目前为止已经波及到欧洲和亚洲的各个国家，并且有上升的趋势。据泰国对规模化猪场保育猪的10种主要疾病统计，渗出性皮炎发生率为25.3％，仅次于链球菌病(31.6％)，名列第2位。在美国最常见的保育猪疾病是链球菌病、渗出性皮炎。据相关报道，邓朝阳，甘海霞等于2001年报道了广西某猪场发生的渗出性皮炎的流行状况及治疗情况；殷凤斌，米瑞娟等在2002年报道了发生在东北的猪渗出性皮炎的病原鉴定；郑金燥于2005年报道了福建省德化县两例猪渗出性皮炎中西医结合的诊治情况；睢艳平，徐镔蕊等在2006年报道该病在北京的发病情况；包小华、操传斌等于2008年报道了猪葡萄球菌引起人的多器官功能衰竭的病例；杨先富^[10]等于2009年报道了猪葡萄球菌病的诊断与治疗情况，所有报道均显示该病已成为一种新的影响人类健康和养猪业发展的重要疫病之一。

猪葡萄球菌所产生的这些脱落毒素是造成猪渗出性皮炎的主要致病因子之一，它是一种细胞外分泌的蛋白质，分子量大约30KD。丹麦研究者首先通过PCR和Western-blot对产生的脱落毒素进行了分析和研究，将脱落毒素分为4种类型，并分别命名为EXHA、EXHB、EXHC、EXHD，其中EXHD的抗原性不同于其他3种毒素的抗原性。研究结果还表明EXHA、EXHB这两种毒素蛋白是一种金属蛋白，他们的分泌和一些二价金属离子有密切的关系，在培养基中加入二价金属离子比未加入二价金属离子产生的EXHA、EXHB毒素蛋白的量高一倍。这4种脱落毒素的基因大小约为816bp～834bp，这些基因携带一些质粒，并受这些质粒的调控。在日本，研究人员在对猪葡萄球菌的研究中发现了另外两种毒素蛋白，分别命名为SHETA、SHETB。另外，猪葡萄球菌引起的渗出性皮炎主要与DSG1(桥粒核心蛋白)有关，DSG1是一种钙依赖性蛋白，EXHA、EXHB、EXHC和EXHD可以将这种靶蛋白裂解，从而导致真皮表面的角化细胞发生脱落，引起猪群发生渗出性皮炎。猪葡萄球菌的这些复杂结构可能在不久的将来成为我们关注的一个热点。虽然，在丹麦和日本已经有了一些相关的研究，大多都是研究其致病机理，对该病在临床上的诊断研究还较少，特别是在鉴别诊断上还难以将其他的皮肤病区分开。临床上缺少一种快速高效、简便易操作的诊断方法。因此，本研究通过对这六种脱落毒素基因的克隆表达，纯化出纯度在90％以上的重组蛋白质，以此为抗原来包被具有高吸附性的材料上，建立一种检测ExhA、ExhB、ExhC、ExhD、ShetA、ShetB等毒素抗体的诊断试剂盒，从而解决该病在临床上诊断的不便之处。

目前，采用的诊断方法有临床症状、病理变化、细菌学的分离鉴定、生化试验、冰冻组织切片、PCR、免疫印迹分析和ELISA等。

根据症状和病理变化的诊断是临床诊断中最基本的方法。通常发病猪的表现为不发热，全身皮肤粘胶样渗出，恶臭，形成黑色痂皮，肥厚干裂等，其外观和在同一窝小猪中严重程度不同，这些都是该病的特征。

细菌学方法如下：通常是采取化脓的皮肤、组织或脓性渗出物等做涂片和分离培养，经革兰氏染色后，用显微镜观察，并依据细菌的形态、排列和染色特性等进行诊断；另外，猪葡萄球菌具有一个独特的生物学特性，在血平板上不发生溶血现象，在麦康凯培养基上不生长。