[发明专利]一种抗生链霉菌及其活性产物制成的生物制剂与应用

权利要求书

1.一种抗生链霉菌(Streptomyces antibioticu)，其特征在于名称为抗生链霉菌H74-18，于2010年12月27日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2010364。

2.一种抗霉素A18(1)，从权利要求1所述的抗生链霉菌H74-18中分离得到，其特征在于：分子式为C₂₈H₄₁N₂O₉，分子量为549.3，结构式如式I所示：

(式I)

其中R1为-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₃；

R₂为-CH(CH₃)CH(CH₃)CH₃。

3.权利要求2所述的抗霉素A18(1)的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)抗生链霉菌H74-18的活化；

(2)抗生链霉菌H74-18的发酵，具体为：

①种子液的制备：将步骤(1)活化的抗生链霉菌H74-18接种到培养基中，28℃下160～180rpm摇瓶培养48h，得到种子液；

②发酵液的制备：将种子液以体积百分比10％的接种量接至30L发酵罐中培养，初始pH值7.0～7.2，发酵温度为28℃，搅拌速度为300r/min，培养72h；

所述的发酵培养基组成为：酵母粉25g，玉米淀粉20g，海水精3g，CaCO₃2g，KNO₃ 2g，K₂HPO₄·3H₂O 0.66g，FeSO₄·7H₂O 0.02g，MgSO₄·7H₂O 1.03g，水定容至1000ml，pH值为7.2～7.4，于115～121℃灭菌30min；

(3)抗霉素A18(1)的提取

①发酵液8000r/min离心30min，收集菌体；菌丝体在pH值为3.0、体积百分比70％的乙醇中振荡24h，然后用乙酸乙酯萃取；萃取液减压浓缩得到粗提物；

②利用规格200-300目的硅胶柱对粗提物进行层析，采用干法装柱，石油醚∶乙酸乙酯梯度洗脱，梯度比例为体积比5∶1、3∶1、1∶1和1∶3，每个梯度为1000mL，洗脱速度为10mL/min，每100mL收集一个样品，分部收集洗脱液，得到40个组份，将第16～36组分合并，得到洗脱液A；

③将洗脱液A用按体积比3∶1混合的石油醚/甲醇混合液萃取，得到去除大部分油脂后的物质，再过规格为50～100目的葡聚糖柱，甲醇∶氯仿梯度洗脱，梯度依次为体积比9∶1、7∶1、5∶1、3∶1、1∶1、2∶1和4∶1，每浓度梯度为500mL，洗脱的总体积是3500mL，流速5mL/min，每100mL为一个组分；将第10至15组分合并，再用规格为200-300目的硅胶柱层析分离，洗脱剂为体积比5∶1混合的石油醚/丙酮溶液，总体积为200mL，10mL收集一份，总共收集20个组分，将第10～11组分合并为组分E；

④将步骤③得到的组分E继续用规格为200-300目的硅胶柱分离，洗脱条件为按体积比5∶1混合的石油醚/丙酮溶液，洗脱总体积为200mL，每20mL收集一份，得到10个组份；

⑤将步骤④得到的活性组份4减压浓缩，得白色晶体S，将S溶解于按体积比1∶1混合得到的石油醚/丙酮溶液中，置4℃冰箱重结晶。

⑦采用高效液相色谱对组份S进行分离纯化，收集峰面积大的馏份，得到抗霉素A18(1)；色谱条件：色谱柱为C¹⁸反相硅胶柱，甲醇/水＝50∶50；流速：1.0mL/min；吸收波长：320nm。

4.根据权利要求3所述的抗霉素A18(1)的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的活化的方式为使用斜面培养基于28℃培养菌株H74-18，直至菌丝和孢子生长成熟。