[发明专利]一种用于肺癌诊断的分子信标复合物及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于一种用于测定或检验核酸的分子信标，特别涉及一种测定或检验miR-155的分子信标的复合物。

背景技术

微小RNA(microRNA，miRNA)的检测方法很多。Northern杂交是检测miRNA在组织细胞中的表达水平的一种简便而可靠方法，可经凝胶电泳检测miRNA的分子大小经典的方法是Northern-blot，但需要总RNA量较多。基因芯片技术和实时荧光定量PCR被应用于miRNA的系统研究和定量检测，但步骤烦琐，成本较高，易受到逆转录效率的限制。荧光原位杂交(FISH)等方法是相对简化的方法，然而miRNAs原位检测系统相对较少，主要的原因是低拷贝、且片断较小。尽管通过采取碱基修饰的探针能显著提miRNA/cDNA

杂交复合物熔链温度，miRNA/cDNA杂交复合物熔链温度过低，难于耐受复杂的漂洗等过程。更为重要的是，传统的miRNA检测方法难以实现完整细胞内miRNA的特异性检测。分子信标可确保反应不受其前体及基因组DNA污染等因素的干扰，对序列高度同源的miRNA也可精确区分；超宽的定量线性范围和高度的检测灵敏度，从几个拷贝到几万个拷贝，定量线性范围跨越7个数量级；样品消耗少，仅需1～10ng的总RNA；适用范围广，总RNA、细胞裂解物以及纯化的RNA都可用于miRNA的定量检测，尤其适用于活体细胞miRNA的检测。

现有技术中已有用于定量检测miR-155表达的分子信标。miRNA可能成为肿瘤早期诊断的生物新靶标。不同肿瘤具有不同的miRNA表达模式，通过miRNA表达谱的分析，将有助于临床上对肿瘤进行诊断、分期及预后的估计。组织中miRNA的异常表达能作为诊断肿瘤的标志物。microRNA的表达情况与包括I期肿瘤在内的肺腺癌的生存相关。研究发现，人miR-155(hsa-miR-155)高表达与预后不良有关；hsa-miR-155高表达是预后不良的因素。miR-155可作为肺癌的一种肿瘤标志物，用于肺癌的诊断与鉴别诊断。分子信标具有背景信号低，灵敏度高、特异识别性强、操作简单，不必与未反应的探针分离即可实时检测，可用于活体分析等优点。在生物化学分析，生物医学研究和临床诊断中有着广泛的应用价值。目前已通过基因芯片筛选出肺癌miRNA表达谱并对其功能进行了鉴定，本发明选择与肺癌发生及预后相关的miR-155进行检测，但常规分子信标用于活细胞内mRNA的检测分析时，由于细胞内核酸酶对分子信标骨架的降解和破坏作用，常导致假阳性信号的产生。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种能够抵御活细胞内核酸酶的降解作用，对活细胞内miR-155进行检测，从而实现对肺癌的诊断与鉴别诊断的分子信标的复合物。

为了解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：一种用于肺癌诊断的分子信标复合物，包括磁性纳米微球以及吸附在磁性纳米微球上的分子信标，所述分子信标其序列为

5’-Alexa488-CCAGCG-acc+Cct+Atca+Cgat+Tagcattaa-CGCTGG-BHQ1-3’，其中CCAGCG为5’端茎状序列，CGCTGG为3’端茎状序列，发光基团为Alexa488，萃灭基团为BHQ1，acc+Cct+Atca+Cgat+Tagcattaa为环状序列，其中环状序列中用大写表示的碱基是进行锁核酸修饰处理后的碱基；所述磁性纳米微球包括磁性纳米颗粒以及在包被磁性纳米颗粒表面的壳聚糖。