[发明专利]一种层析法提取破伤风人免疫球蛋白的方法

权利要求书

1.一种层析法提取破伤风人免疫球蛋白的方法，包括：

(a)从血浆中用低温乙醇法制备组分I+II+III沉淀；

(b)从组分I+II+III沉淀中制备组分II沉淀；

(c)溶解组分II沉淀，对溶解液进行离子交换层析；

(d)对层析液进行超滤，透析；

(e)病毒灭活；

(f)配制分装。

2.根据权利要求1所述的一种层析法提取破伤风人免疫球蛋白的方法，其特征在于其所述的步骤(a)的低温乙醇法按以下步骤进行：将血浆解冻并混合后，加入醋酸缓冲液调节其PH值为5.8～6.2，加入预冷的95％乙醇，使反应液的乙醇浓度为18％～22％，调整温度在-4～-6℃，加入助滤剂后用压滤机进行过滤，得到组分I+II+III沉淀。

3.根据权利要求1所述的一种层析法提取破伤风人免疫球蛋白的方法，其特征在于其所述的步骤(b)从组分I+II+III沉淀中制备组分II沉淀按以下步骤进行：将组分I+II+III沉淀溶解于5～8倍量0℃的注射用水中，使反应液温度维持在0℃，搅拌3小时以上，加入醋酸缓冲液，调节反应液pH值为5.15～5.35，加入预冷的95％乙醇，使反应液的乙醇浓度为17％～19％，在加入乙醇过程中，冷却反应液，最终温度达到-4.5～-5.5℃，加完乙醇后，加入助滤剂，用压滤机过滤，收集过滤上清液，向上清液中加入1M碳酸氢钠缓冲液，调节其pH值为7.20～7.60，加入预冷的95％乙醇，使反应液的乙醇浓度为24％～26％，在加入乙醇过程中，冷却反应液，使反应液的最终温度为-10～-12℃，用压滤机过滤，得到组分II沉淀，即为破伤风人免疫球蛋白的粗品。

4.根据权利要求2或3任一所述的一种层析法提取破伤风人免疫球蛋白的方法，其特征在于其所述的步骤(c)中溶解组分II沉淀，是用3～5倍量预冷的0℃的注射用水溶解，过滤澄清。

5.根据权利要求4所述的一种层析法提取破伤风人免疫球蛋白的方法，其特征在于其所述的步骤(c)中的阴离子交换层析是按以下步骤进行的：在组分II溶解液中加入3％盐酸，调节其pH值为6.5～6.7，用5％氯化钠溶液调节溶液的电导为1.30～1.50ms/m，将层析柱用pH值为6.5～6.7的0.03M磷酸盐缓冲液平衡至出液的pH值为6.5～6.7后，上样，收集流出的蛋白峰，上样结束后，用0.03M磷酸盐缓冲液冲洗凝胶上的残余蛋白，合并上述两项蛋白液称重。

6.根据权利要求1所述的一种层析法提取破伤风人免疫球蛋白的方法，其特征在于其所述的步骤(d)中是按以下步骤进行的：将调整好的蛋白液抽至清洁的反应罐中，启动超滤器，开始预浓缩，蛋白浓度达到5％～6％(g/ml)时，加入7倍2℃注射用水进行透析，透析过程中注意补加3％盐酸适量，透析结束后，用3％盐酸调整浓缩后蛋白液的pH值为3.8～4.0，加入麦芽糖，补加注射用水，使制品人免疫球蛋白含量为50～52g/L，麦芽糖含量为9％～11％(g/ml)。

7.根据权利要求2或3所述的一种层析法提取破伤风人免疫球蛋白的方法，其特征在于，上述步骤中所用的助滤剂为硅藻土，加入量为药液量的0.5％～2.0％(g/ml)。

8.根据权利要求1所述的一种层析法提取破伤风人免疫球蛋白的方法，其特征在于，上述步骤(c)中的离子交换层析是采用阴离子型的离子交换层析介质。

9.根据权利要求8所述的一种层析法提取破伤风人免疫球蛋白的方法，其特征在于，所述的阴离子交换层析介质是二乙氨乙基交联琼脂糖凝胶。

10.根据权利要求1所述的一种层析法提取破伤风人免疫球蛋白的方法，其特征在于步骤(e)中所述的病毒灭活包括低PH孵放和纳米膜过滤两个步骤。

11.根据权利要求10所述的一种层析法提取破伤风人免疫球蛋白的方法，其特征在于步骤(e)中所述低PH孵放和纳米膜过滤是按以下步骤进行的：把透析后的免疫球蛋白制品从反应罐经滤筒除菌于无菌容器中，置于21℃库放置21天，使制品在pH为3.8～4.0，含9～11％(g/ml)麦芽糖的条件下进行低pH病毒灭活，然后用纳米膜滤芯进行除病毒过滤。

12.根据权利要求1所述的一种层析法提取破伤风人免疫球蛋白的方法，其特征在于步骤(f)中所述的配制分装是按以下步骤进行的：将病毒灭活后的蛋白液抽至清洁的超滤桶中，启动超滤器，开始预浓缩待蛋白浓度为95g/L～115g/L时，用注射用水恒体积透析2倍，透析结束后将制品浓缩至蛋白浓度大于130g/L，抽入洁净不锈钢桶内用0.1M NaOH调整浓缩后蛋白液的pH值为6.6～7.0，根据破伤风人免疫球蛋白的效价，补加注射用水，加入麦芽糖，使最终制品人免疫球蛋白含量115～125g/L，麦芽糖含量50g/L，破伤风抗体效价为120IU/ml，分装，为破伤风人免疫球蛋白成品。