[发明专利]pET15b-PEP-1-VP3质粒及构建、PEP-1-VP3融合蛋白及表达

说明书

技术领域

本发明涉及质粒pET15b-PEP-1-VP3的构建及PEP-1-VP3融合蛋白的表达。

背景技术

VP3是新近发现的由鸡贫血病毒编码产生的小分子蛋白(编码VP3基因全长366bp，编码的产物VP3蛋白由121个氨基酸组成，分子量为13. 6 kD)， VP3蛋白具有广谱的诱导肿瘤细胞凋亡作用，而对正常细胞无凋亡活性和无毒性，因此，VP3蛋白很可能成为一种抗肿瘤候选药物，但前提是VP3蛋白必须在细胞内才能发挥其诱导肿瘤细胞凋亡的效应，VP3蛋白不能以天然活性形式穿透细胞，由于缺乏有效的把VP3蛋白导入细胞的方法而限制了其生物学活性的发挥。

发明内容

为了把VP3蛋白导入细胞内部，发挥其特异性诱导肿瘤细胞凋亡的作用，本发明提供了一种可以以天然活性形式穿透细胞的pET15b-PEP-1-VP3质粒及构建、PEP-1-VP3融合蛋白及表达纯化方法。

pET15b-PEP-1-VP3质粒，其中以图1所示的pET15b为表达载体，PEP-1-VP3基因序列见序列表1。

PEP-1-VP3融合蛋白，其氨基酸序列见序列表2。

一、所述的pET15b-PEP-1-VP3质粒的构建：

（1）PCR反应及其产物的鉴定、回收和纯化

以PGEX-6P-1/TAT-VP3质粒为模板，设计合成上下游引物进行PCR扩增，扩增条件：起始变性95℃ 1min，然后执行如下反应：95℃ 30s，68℃ 3min，35个循环，最后68℃ 延伸3min。PCR产物经低熔点琼脂糖凝胶电泳后鉴定，回收并纯化366bp的VP3 cDNA片段。

（2）同源重组反应

运用靶向克隆酶，将纯化后的VP3 cDNA与带有共同酶切位点及相同末端序列的线性pET15b-PEP-1进行同源重组连接。

（3）转化、筛选及测序鉴定

将重组连接产物转化大肠杆菌DH5a，并涂布到含氨苄青霉素（100ug/ml）的琼脂TB培养基上16小时，挑选白色单菌落接种于含有氨苄青霉素（100ug/ml）的TB培养基中培养24小时，少量提取质粒，通过Xho Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切电泳鉴定，然后将质粒测序鉴定。

二、PEP-1-VP3融合蛋白的表达及纯化

（1）PEP-1-VP3融合蛋白的表达

 将pET15b-PEP-1-VP3重组质粒转化E.coli（Rosetta），铺在含氨苄青霉素（100ug/ml）的TB培养基上16小时，挑取单个菌落至200ml含有氨苄青霉素（100ug/ml）的TB培养基中37℃下放大培养，当细菌生长至OD 600值为0.5-1.0时加入0.83mol/L IPTG至终浓度0.83mol/L，置25℃下诱导培养12小时，4℃5000rpm离心5min，收集菌体，然后用PBS洗涤3次。

（2）PEP-1-VP3融合蛋白的纯化 

因表达的PEP-1-VP3融合蛋白主要以包涵体形式存在，故参照文献将收集的菌体溶于50ml缓冲液A（1×PBS，20mM咪唑，6M尿素，PH8.0）中，400W、10min、间隔5min，4℃超声破菌破包涵体41min，破菌完全的菌液较清，置超速冷冻离心机中20000rpm、4℃离心10min。，融合蛋白以可溶性形式存在于上清中，将上清缓慢加入Ni²⁺-氮基三乙酸琼脂糖亲和层析柱，上样完毕后，杂交结合3小时，以便使融合蛋白上的6个组氨酸标签与层析柱内的Ni²⁺结合，用10倍体积的缓冲液A过柱，洗去未结合的杂蛋白，然后用洗脱缓冲液B（1×PBS，500mM咪唑，6M尿素，PH7.5）将融合蛋白洗脱下来。

本发明通过克隆VP3基因，用基因工程手段构建出pET15b-PEP-1-VP3重组质粒，表达出PEP-1-VP3融合蛋白，然后通过纯化，较高地表达和纯化出PEP-1-VP3融合蛋白从而成功制备了可穿透细胞的PEP-1-VP3融合蛋白，为特异性诱导肿瘤细胞凋亡奠定了基础。

附图说明

图1是pET15b-PEP-1-VP3质粒的构建流程图。

图2是PCR扩增产物的电泳图。

图3是pET15b-PEP-1-VP3重组质粒用Xho Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切鉴定图。

图4是裂解细菌总蛋白纯化前后行12%SDS-PAGE电泳结果。

图5是裂解细菌总蛋白纯化后行Western bloting结果。