[发明专利]鹿结核病间接酶联免疫吸附检测法

说明书

技术领域

本发明属于兽医领域。具体涉及鹿结核病血清检测诊断方法。

背景技术

鹿结核病(Deer tuberculosis)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium)引起的鹿的一种慢性、消耗性传染病，广泛流行于世界各地，几乎每个国家的鹿场都曾发生过结核病或曾经检出过结核病菌。近年来，鹿结核病在国内外养鹿场广有流行，造成巨大的经济损失，严重影响了养鹿业的发展。目前，没有专门用于鹿结核病特定的检测方法。以往多沿用其他家畜结核病的传统方法，检测结果特异性较差，敏感性较低，过程较复杂。

发明内容

本发明的目的是提供一种鹿结核病间接酶联免疫吸附检测法。用于鹿结核病的诊断，克服以往鹿结核病检测特异性差，敏感性低等不足。

本发明检测方法选用的生物材料有：牛型提纯蛋白衍生物(PPD)、兔抗鹿IgG，兔抗鹿IgG-HRP、标准阳性血清、标准阴性血清、待检血清。

本发明检测方法的步骤是：

1、包被抗原

在酶标板上选定待检血清孔、阴性对照孔、阳性对照孔、抗原对照孔、抗体对照孔、酶结合物对照孔、空白对照孔；将牛型提纯蛋白衍生物(PPD)用抗原稀释液稀释成10-50μg/ml后，等量加入上述各孔中。在35-42℃湿盒内2-4小时包被后3×3′洗涤。

2、加血清

用血清稀释液将待检血清按血清比稀释液为1∶50-1∶150的比例稀释，在待检血清孔中加待检血清、标准阳性对照孔和抗体对照孔加阳性血清，标准阴性血清对照孔加阴性血清，抗原对照孔加入血清稀释液，加入量均相同于步骤1所加抗原的体积量，35-42℃湿盒内孵育0.5-1.5小时，3×3′洗涤。

3、加酶结合物-兔抗鹿IgG-HRP

将兔抗鹿IgG-HRP用抗原稀释液按兔抗鹿IgG-HRP比稀释液为1∶2000-1∶8000的比例稀释，将将兔抗鹿IgG-HRP液加入全部待检血清孔和对照孔中，每孔加入量相同于步骤1加入的抗原液体积量，35-42℃湿盒内孵育0.5-1.5小时，3×3′洗涤。

4、加底物-兔抗鹿IgG

在完成步骤3的酶标板上全部待检血清孔和对照孔中加兔抗鹿IgG，作为底物反应，每孔加入量相同于步骤1加入的抗原液体积量，35-42℃湿盒内孵育10-20分钟；

5、终止反应

在完成步骤4的酶标板上全部待检血清孔和对照孔中加2摩尔质量硫酸终止反应；每孔加入量为步骤1加入的抗原液体积的1/2。

6、用酶联免疫检测仪测量

将完成步骤5的培养板置于酶联免疫检测仪上，在490nm处空白调零，测各孔的OD值；以PPD的OD值≥0.56为阳性。

上述的抗原稀释液为：按碳酸钠(Na₂CO₃)0.318g，碳酸氢钠(NaHCO₃)0.560g，加去离子水后得1000ml溶液的用料比例，先用少量固体物溶解，待完全溶化后补全部去离子水，混匀所得到的溶液。

上述的血清稀释液为：按牛血清白蛋白0.1g，洗液100ml的比例，溶化混匀所得溶液

本发明中使用的兔抗鹿IgG通过以下过程制备：

取来自健康鹿的血清，用50％饱和(NH4)₂SO₄盐析一次后，再用37.5％饱和(NH4)₂SO₄盐析三次，提取鹿血清IgG：充分透析至无NH⁴⁺、SO₄²⁺。以0.01MpH8.0磷酸缓冲液透析平衡，过DEAE-32柱。以0.01M pH8.0磷酸缓冲液洗脱，收集蛋白部分，测定蛋白含量；以聚丙烯酰胺圆盘电泳鉴定其纯度。以鹿血清对照，若在加有过柱鹿血清IgG的凝胶管内仅有一条带，且此带的位置恰与加鹿血清的凝胶柱上的γ-球蛋白带组中最后一条带相一致，则说明所提蛋白为鹿IgG，且纯度高。将所提鹿血清IgG浓缩，-20℃冰箱中保存备用。

本发明中使用的兔抗鹿IgG-HRP按以下用量或用量相等倍数变化所取的原料及过程制备：