[发明专利]一种半成熟树突状细胞的体外制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物学和医学技术领域，特别涉及一种半成熟树突状细胞的制备方法。

背景技术

树突状细胞(DCs)是构成机体细胞免疫的两大核心之一，不同树突状细胞亚型指导不同效应性T细胞的分化，从而决定着机体免疫系统在识别外来抗原中行使免疫应答抑或免疫耐受两种截然不同的功能。大量研究已证明不成熟树突状细胞(iDCs)，完全成熟树突状细胞(mDCs)和半成熟树突状细胞(semi-mature DCs)在介导机体免疫系统行使免疫耐受还是免疫应答中起着完全不同的决定性作用。从解决组织、器官移植排斥和治疗自身免疫性疾病的目的出发，人们正在不懈地努力以寻找具有诱导机体免疫耐受的半成熟树突状细胞。因此，其理论意义和临床应用价值显而易见。

最新报道，采用不同方法制备的半成熟树突状细胞具有不同的特性，因而有充分理由推测它们所诱导机体免疫耐受的效果及其机制也不同。迄今为止，已报道有3种不同特性的半成熟树突状细胞，即semi-mature DCs^IL-10、semi-matureDCs^IL-6和semi-mature DCs^TNF-α及其制备方法。

Sato K等通过分离人的外周血单个核细胞，用GM-CSF(50ng/ml)和IL-4(50ng/ml)在体外培养7d，然后加入TNF-a(50ng/ml)或LPS(100ng/ml)继续培养3d；也可用IL-10(50ng/ml)培养细胞3d，然后加入TNF-a(50ng/ml)orLPS(100ng/ml)继续培养3d，获得semi-mature DCs^IL-10。semi-mature DCs^IL-10的主要特性是TNF-α、IL-6和IFN-γ降低，MHC-II、CD80和CD86也降低。

Park SJ等在体外用含10ng/ml GM-CSF或0.5％GM-CSF上清的完全培养基培养小鼠骨髓细胞，每2d用DC培养基换液，弃非粘附细胞，培养6d，即分化为骨髓来源树突状细胞(BMDCs)，之后用50ng/ml IL-6刺激，再加入100ng/mlLPS、40ng/ml TNF-α或40μg/ml anti-CD40抗体，获得semi-mature DCs^IL-6。semi-mature DCs^IL-6的主要特性是TNF-α和IL-12降低，CD40、CD80和CCR7也降低。

Menges M等在体外用GM-CSF(200U/ml)或细胞系分泌的含10％GM-CSF上清诱导培养小鼠骨髓细胞分化为BMDCs，然后加入TNF-α(500U/ml)，LPS(1μg/ml)或LPS联合anti-CD40抗体(5μg/ml)培养24h，即获得semi-mature DCs^TNF-α。semi-mature DCs^TNF-α的主要特性是TNF-α、IL-6和IFN-γ降低，而MHC-II、CD80和CD86则升高。

以上可见，采用不同方法制备的半成熟树突状细胞具有不同的细胞表型特性和产生不同水平的细胞因子，因而提示它们所诱导机体免疫耐受的效果及其机制迥异，确切功能仍有待证实。其中，有的需要分别用诱导成熟和抑制成熟的两种因素或多种因素去处理iDCs，以致制备技术较繁，又因依赖于两种作用完全相反的因素导致树突状细胞的半成熟程度难以控制，DCs分化的机制及功能也就不同。因此，我们探索单因素控制的新型半成熟树突状细胞亚群的制备技术。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种半成熟树突状细胞的体外制备方法，包括以下步骤：

(1)冰浴上收集小鼠骨髓细胞悬液，离心弃上清；

(2)将步骤(1)离心得到的细胞重悬于磷酸缓冲液(PBS)中，加入细胞悬液体积15-20倍的红细胞裂解液，37.0℃避光作用8-10min，然后离心；

(3)将步骤(2)离心得到的细胞重悬于含10％胎牛血清的RPMI 1640完全培养基中；

(4)在步骤(3)得到的细胞悬液中加入10-20μg/L重组小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rmGM-CSF)、2.5-10μg/L重组小鼠白细胞介素4(rmIL-4)和1-5mg/L重组嵌合蛋白(Jagged-1/Fc)；

(5)置于培养箱中孵育；