[发明专利]圣路易斯脑炎病毒样颗粒的制备方法及其应用

权利要求书

1.一种圣路易斯脑炎病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，该方法具体为：

1）选取 GenBank数据库中圣路易斯脑炎病毒Hubbard的基因序列、基因序列序列号为EU566860，进行圣路易斯脑炎病毒基因的合成，获得重组质粒；

2）重组质粒转染哺乳动物细胞293T，转染的293T细胞收获后进行瞬时表达分析；

3）通过相应的纯化方法获得相应的表达蛋白，并形成圣路易斯脑炎病毒样颗粒。

2. 如权利要求1所述的圣路易斯脑炎病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，所述步骤1）中PCR方法进行圣路易斯脑炎病毒基因的合成，该PCR方法具体为：

1）设计用于信号肽和SLEV-ME基因融合PCR的上下游引物，外源信号肽上游引物JF:5’CGggatccGCCACCATGGGAAAACGGTCAGCG 3’和下游引物JR:5’TGATAGGTTGACAACTGCAAGGCTCCTGCACAAGCTATGA 3’；ME上游引物 MEF：5’ TCATAGCTTGTGCAGGAGCCTTGCAGTTGTCAACCTATCA 3’和下游引物MER：5’ CCGctcgagCTATTAATGATGATGATGATGGTGGGC 3’；

2）以划线部分分别为BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点，以信号肽和SLEV-ME基因为模板，通过融合PCR扩增JME基因全长；

3）凝胶回收试剂盒胶回收SLEV-JME片段，分别对SJME和pcDNA5/FRT进行BamHⅠ、XhoⅠ双酶切，胶回收后T4 DNA连接酶连接，将连接产物转化DH5α，挑取单克隆菌落，扩菌提取重组质粒。

3. 如权利要求1所述的圣路易斯脑炎病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，所述步骤2）中重组质粒转染哺乳动物细胞293T的具体步骤为：转染前18-24小时接种细胞到T25细胞瓶中；将10ug质粒加入1ml无血清培养基中，再加入20ulPEI，室温孵育10min;倒掉旧的培养基，用无血清培养基洗两遍；加2ml培养基，37℃/5%CO2孵育3小时后补加2ml培养基，72小时后进行瞬时表达分析。

4. 如权利要求1所述的圣路易斯脑炎病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，所述步骤3）中纯化方法具体为：

1） 将所述转染的293T细胞收获物经反复冻融及超声破碎；

2） 将上清和破碎细胞离心去除细胞碎片；

3） 将澄清上清通过0.45um的过滤器过滤；

4） 收集上清，100KD超滤浓缩后加PBS离心缓冲液重复超滤浓缩；

5） 弃去上清， PBS重悬；

6） 用10%-60%的连续性蔗糖梯度离心；

7） 离心分层后，逐层向下穿刺收集各个层面的所有样品，分层收集各样品包被ELISA通过E蛋白单克隆抗体或圣路易斯脑炎病毒多克隆血清确定重组蛋白位置，获得圣路易斯脑炎病毒样颗粒。

5. 一种以圣路易斯脑炎病毒样颗粒的293T细胞为抗原建立的间接免疫荧光检测方法，其特征在于，该方法具体为：收集转染设定时间后的细胞，用预冷的1xPBS清洗细胞，取适量细胞滴到八孔显微镜载玻片上，晾干，用冷丙酮进行固定，加入稀释的抗SLEV抗体37度孵育设定时间，漂洗液洗涤; 加入异硫氰酸荧光素标记的山羊抗小鼠IgG 室温结合；漂洗液洗涤后于荧光显微镜下观察。

6. 一种以纯化的圣路易斯脑炎病毒样颗粒为抗原建立的蛋白印迹检测方法，其特征在于，该方法具体为：

1）裂解的蛋白行SDS-PAGE后转膜；

2） 封闭：将膜放入可密封的塑料袋中，加入适量的TBS配置的脱脂奶封闭液中，室温封闭设定时间；

3）抗体的结合：用TBS配置的脱脂奶稀释纯化的抗SLEV 鼠单克隆抗体作为一抗，将PVDF膜与稀释好的抗体室温摇床孵育设定时间；

4）洗去未结合的抗体：用TBS-T漂洗滤膜；

5）二抗的结合：用TBS配置的脱脂奶稀释HRP标记的羊抗鼠IgG抗体作为二抗，将洗涤后的PVDF膜与稀释好的二抗室温摇床孵育设定时间后，将膜用TBS-T洗涤；

6）DAB显色：用TBS洗涤膜，去除磷酸和Tween 20，将膜放入DAB底物显色液中显色，注意观察显色情况，至棕色条带出现时终止反应，照相后避光保存。