[发明专利]一种香蕉穿孔线虫特异性LAMP检测方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及植物病害的分子生物学检测技术，特别涉及一种香蕉穿孔线虫特异性LAMP检测引物及LAMP快速分子检测方法

背景技术

香蕉穿孔线虫(Radopholus similis)，，又名相似穿孔线虫，它是一种具有毁灭性的外来入侵植物检疫性有害线虫，是我国对外植物检疫对象之一。香蕉穿孔线虫(Radopholus similis)寄主范围也非常广泛，目前已报道的寄主多达360多种，主要分布在在热带及亚热带地区。

近年来，随着国际贸易和出国旅游日趋频繁，从香蕉穿孔线虫疫区国家或地区引进各种花卉苗木及种质材料的种类和数量迅速增加，因此由寄主植物携带而将该线虫传入中国的可能性和传入风险日益剧增。近年来在我国各口岸多批次截获香蕉穿孔线虫。由于该线虫的寄主植物在中国广泛分布，一旦入侵后将给我国农业生产带来毁灭性的打击和造成严重的损失。一旦香蕉穿孔线虫扩散到田野，则极易定殖和流行。这将给中国的农业生产造成严重危害。

在香蕉穿孔线虫的鉴定与检测方面，往往以形态鉴定为主，但因为形态特征细微复杂，变化幅度较大及表型特征不稳定问题，传统形态鉴定往往比较困难，导致误诊，传统形态鉴定过程耗时、费力，需要专业人士操作，且需要大量线虫样本，在单头线虫水平上不能达到要求。在PCR技术上建立起来的分子鉴定方法，一定程度上克服了传统形态鉴定上的缺陷。目前已有一些利用分子和生化方法鉴定香蕉穿孔线虫的方法，如RFLP、一步双重PCR和荧光定量PCR。在植物检疫领域中，DNA分子标记是目前线虫学研究中发展较快的一种鉴定手段。线虫种特异性引物PCR扩增检测或双重PCR扩增检测是近年重要植物线虫分子诊断的重要进展之一。通过一次PCR测验就可以在混合样品中特异性地检测出一个或多个线虫种。如Mulholland et al.(1996)分别构建了马铃薯金线虫和马铃薯白线虫的特异性引物，描述了一种基于rDNA-ITS区域特异性等位多重PCR技术检测这两种线虫的方法，能快速鉴定马铃薯白线虫和马铃薯金线虫及其复合种群。与标准的PCR途径不同，这一技术在每个PCR反应中应用了3个引物，通用引物5.8SrRNA、马铃薯金线虫的特异性引物ITS1-Gr和马铃薯白线虫的特异性引物ITS1-Gp。Bulman & Marshall(1997)成功应用多重PCR技术快速诊断马铃薯孢囊线虫。在研究了秘鲁和澳大利亚的马铃薯金线虫和马铃薯白线虫的rDNA-ITS的序列结构基础上，构建了马铃薯金线虫的特异性引物PITSr3和白线虫的特异性引物PITSp4，通用引物ITS5与PITSr3可以扩增343bp马铃薯金线虫的特异性片段，与PITSp4可以扩增出265bp特异性识别马铃薯白线虫的DNA片段。在一个PCR反应中，使用PITSr3，PITSp4和ITS5这3个引物，即使复合种群中金线虫DNA的含量仅为白线虫的百分之一，也能从复合种群检测出金线虫。

欧师琪、彭德良(Ou SQ，Peng DL，2008)设计构建了大豆孢囊线虫特异性SCAR标记引物SCNFI和SCNRI，发明了大豆孢囊线虫的一步双重PCR检测方法，检测的特异性片段长度为494bp，建立快速准确检测和早期诊断大豆孢囊线虫的分子生物学方法和技术规程，可以检测大豆孢囊线虫单个孢囊、单头二龄幼虫和雄虫，该项检测技术获得国家发明专利(ZL200510012246.1).

宛飞、彭德良等(2008)根据马铃薯腐烂茎线虫rDNA-ITS区的序列特征，对我国甘薯茎线虫两个不同型群体各设计了一对特异性引物。A型甘薯茎线虫特异引物为DDS1/DDS2，特异扩增片段为252bp；B型甘薯茎线虫特异引物为DDL1/DDL2，特异扩增片段为485bp；引入线虫通用引物D3A/D3B作内标，研究出一步双重PCR特异性检测甘薯茎线虫不同类型群体的分子技术和方法，该分子检测技术具有特异性强、方法可靠、灵敏性高、操作简便，检测的精确度达到单条线虫的水平。