[发明专利]高速宽视场相干反斯托克斯拉曼散射显微系统及方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种高速宽视场相干反斯托克斯拉曼散射(CARS)显微系统，可广泛适用于生物学、医学，生物物理以及材料化学等领域的研究。

背景技术

在材料化学以及生物学的研究中，科学家往往需要显微镜具有高空间分辨率的同时还能够检测材料或生物细胞的分子构成。随着各种荧光探针的出现，使用不同的荧光探针可以标记样品内部不同的位置，从而可以探测样品的分子构成。荧光显微镜已经成为化学和生物样品成像的有力工具。但是荧光显微技术存在两个缺点：荧光探针的光漂白效应和荧光探针对样品分子结构的影响。

基于分子内部能级振动特性的成像技术(红外光谱和拉曼光谱)，既提供了分子的振动信息，又不用荧光标记，是一种好的选择。但是，红外光的分辨率较低，再加上水在红外波段有较强的吸收，限制了红外光谱在生物样品成像上的应用。将共焦显微技术与拉曼光谱技术结合，对样品进行功能性拉曼光谱成像，称为共焦拉曼显微术。该技术可以避免上述问题，且已经有商业化的产品问世。但是拉曼散射信号强度很低并且难以避免荧光的干扰。如果用来成像，有时需要曝光几个小时。显然不适用于许多需要动态探测的研究。

相干反斯托克斯拉曼散射(Coherent Anti-Stokes Raman Scattering，简称CARS)是一种相干散射过程。如图1(a)所示，与拉曼光谱不同，相干反斯托克斯拉曼散射是一种典型的三阶非线性光学效应，产生CARS需要将两束超短脉冲激光，泵浦光(频率为ω_p)和斯托克斯光(频率为ω_s)，同时汇聚于样品上的一点，当两束光的频率差(ω_p-ω_s)与样品介质的拉曼频率(Ω)相同时，它们会在介质中进行相干混合产生一束新的反斯托克斯拉曼散射光频(ω_as＝2ω_p-ω_s)，即CARS信号。CARS信号以其散射强度高、方向性好、背景干扰小，偏振特性等优点。该技术不仅可以对样品进行光谱研究，还可以在无需对样品染色的情况下对样品进行功能性成像，从而成为分子研究的有力工具。

CARS显微具有以下几个优点：

1、由于CARS是基于分子内部振动特性，所以不需要使用外来的荧光探针，不会对样品分子结构造成影响。

2、CARS信号具有较高的强度和很好的方向性，因此具有比普通拉曼散射显微更高的灵敏度。

3、CARS是一种典型的三阶非线性效应，只能在激光的焦点出产生，通过光束扫描可实现样品的三维层析成像。

4、CARS信号要比样品的荧光信号具有更高的频率，即使在较强的荧光背景中也能被探测到。

5、激发样品的CARS信号通常需要使用短脉冲的近红外钛宝石飞秒脉冲激光器，近红外波段的光束在样品中具有较高的穿透深度和很小的热效应。

国外有很多大学和研究所在开展这方面的研究工作。1999年，AndreasZumbusch等人通过使用共线强聚焦模式，首次得到了横向分辨率为307nm的聚苯乙烯小球在3053cm-1处的三维图像；哈佛大学化学生物学系的Xie小组不仅在理论上对CARS显微术进行了研究，而且对前向探测CARS显微术(F-CARS)、背向探测CARS显微术(E-CARS)、偏振激发探测CARS显微术(P-CARS)、多光谱CARS显微术(M-CARS)、时间分辨CARS显微术(Time-resolved CARS)、外差探测CARS显微术(I-CARS)和频率调制CARS显微术(FM-CARS)等做了细致的试验研究。近年来，有大量文章在Nature、Science、PRL、PNAS、APL、OL等著名学术刊物上发表，许多新的探测技术被应用于CARS显微领域。德国马堡大学Motzkus小组使用整形的单个飞秒脉冲实现了CARS显微；新加坡国立大学Huang等人开展了外差偏振CARS显微的研究，芬兰Lappeenranta大学Vartiainen小组与荷兰阿姆斯特丹大学Bonn小组合作，利用软件处理直接消除CARS非共振背景噪声并应用于微流体化学反应的研究。

CARS显微技术可以广泛应用于生物学，化学以及医学领域。在细胞生物学的研究中，可以用来研究不同生物细胞中脂肪分子的分布与浓度；由于CARS显微使用的近红外的激光束在生物组织内有较大的穿透深度，所以还可以用来进行生物组织的三维成像；在化学领域的研究中，可以对各种有机或无机材料薄膜进行分子结构和化学组成的分析与实时成像观察；在医学研究中，CARS显微还可用于肿瘤的成像。