[发明专利]筛选和鉴定乙肝病毒特异性细胞毒性T淋巴细胞表位方法

说明书

技术领域

本发明属生物技术的细胞生物学和免疫学等领域，涉及应用表达乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)蛋白的细胞作为靶细胞，以候选的表位肽包被人工抗原提呈细胞(artificial antigen-presenting cells，aAPC)体外诱导HBV特异性细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T Lymphocyte，CTL)作为效应细胞，观察效应细胞杀伤靶细胞的效果，以筛选和鉴定HBV特异性CTL表位。

背景技术

慢性乙型肝炎病毒感染的治疗仍然是医学界面临的重大难题，目前抗HBV治疗的药物还不能彻底清除病毒，如何有效清除HBV依然是乙型肝炎治疗研究的热点。

(1)HBV特异性CTL是机体清除HBV的重要因素。研究多克隆、多特异性、强应答的特异性CTL的制备方法，对慢性乙型肝炎的治疗具有重要意义。

已有研究表明，HBV特异性CTL是机体清除HBV的重要因素：急性乙型肝炎患者清除HBV主要由CTL介导，CTL可通过致肝细胞溶解和/或非溶解两条途径清除肝细胞内的HBV(尤其是HBV cccDNA)，发挥抗病毒效应。急性乙型肝炎患者体内的CTL常为多克隆、多特异性、强应答及高IFN-γ分泌的。相反慢性乙型肝炎患者的HBV持续感染与宿主T细胞免疫应答不足相关。研究发现，慢性乙型肝炎患者体内抗原提呈细胞(Antigen Presenting Cells，APC)的抗原提呈功能缺陷，不能把病毒抗原的信息传递给机体的免疫系统，因此慢性乙型肝炎患者体内的特异性CTL常表现为寡特异性、弱应答。由此可见，过继输入足够量的多克隆、多特异性、强应答的特异性CTL来清除病毒，可与目前抗病毒治疗相互补充，解决不能彻底清除肝细胞内病毒的问题。

(2)HBV特异性CTL表位研究的现状

CTL表位是诱导特异性CTL克隆性增殖、分化和发挥效应的最重要的激发因素，近年来倍受重视。目前，HBV特异性CTL表位的研究已经较多。

但HBV特异性CTL表位研究也存在一定的问题：①、未使用覆盖HBV抗原系统全序列的合成肽，可能遗漏部分重要信息；②、只选择与HLA(人类白细胞抗原)分子呈高亲和性结合的肽段进行分析，可能会遗漏亲和力不高却具有较强免疫原性的肽段；③、大多数的研究只是利用有限的常用的表位对不同临床类型乙型肝炎患者的CTL免疫进行分析，而目前临床上有大量的变异病毒出现，这些表位的序列也发生改变，因此这些表位不能用于很多感染变异病毒的患者的研究；④、几乎没有一种HLA限制性HBV CTL表位是由我国报道的，而我国的HBV基因型和欧美国家的HBV基因型有很大差异。因此，全面、精确地对HLA限制性表位进行研究是十分必要和迫切的。

表位研究方法学存在的问题：以往研究是应用克隆技术通过逐步缩小筛查范围来确定免疫表位，并且是应用动物(或人体)实验来鉴定，耗时、耗力、收效低。随着对HLA认识的加深，现可根据不同HLA分子的表位结合基序，通过生物信息学预测某种抗原中可能存在的表位，但是必须结合现代实验技术进行鉴定。

人工抗原提呈细胞(artificial antigen-presenting cells，aAPC)是用人工的方法模拟抗原提呈细胞(APC)的功能——T淋巴细胞活化信号，可在体外活化特异性T淋巴细胞。目前常用的方法是在磁珠表面交联抗CD28单克隆抗体(mAb)和MHC I-Ig：抗原肽复合物，该磁珠可以诱导活化抗原肽特异性的CTL。

aAPC具有较高的可操控性，可人为控制MHC抗原肽复合物，从而实现对CD8⁺T淋巴细胞活化的调控，并有活化条件较均一，质量易控制，T细胞活化增殖周期短等优点。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种体外筛选和鉴定HBV特异性细胞毒性T淋巴细胞表位的方法，采用该方法可以用于大规模的CTL表位的筛选和鉴定。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种体外筛选和鉴定HBV特异性细胞毒性T淋巴细胞表位的方法，包括以下步骤：

1)、制备可负载任意多肽的人工抗原提呈细胞aAPC：

采用MHC I-Ig和抗CD28mAb包被磁珠：用直接包被法将MHC I-Ig和抗CD28mAb包被在磁珠上，构建成可负载任意多肽的人工抗原提呈细胞aAPC；

2)、表位肽负载aAPC：