[发明专利]一类五甲川菁荧光染料、制备方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一类五甲川菁荧光染料，尤其是甲川链的中位发生共轭取代的新型荧光染料与制备方法，以及将该荧光染料用作粘度敏感的荧光探针检测活细胞内微环境粘度的方法。

背景技术

粘度是衡量一种浓稠流体的流动性和扩散性的主要因素，同时是流体扩散速率的主要参考指标。针对宏观大体积的粘稠流体，测定流体粘度的方法和仪器已经发展的比较成熟了，比如转子粘度计、落球粘度计等，然而这一类粘度计只能用于宏观大体积流体粘度测定，需要流体体积在不小于1mL；对微观环境，比如组织、细胞水平的粘度测定，这些测试方法和仪器往往不能达到测试的目的的。而准确测定细胞水平内微环境的粘度又具有非常重要的意义：活细胞内不同位置的粘度不同，这对细胞内生物分子及胞内信号的扩散与传递起着决定性作用。根据K.Suhling小组的工作可知，正常活细胞内膜系统微环境的粘度最高可以达到140厘泊(cp)，而细胞质中的粘度仅1～2cp，相当于纯水中的粘度；当出现病变细胞逐渐死亡的时候，细胞内的粘度会显著提高，最高可以达到300cp，细胞内粘度的显著变化会导致机体出现疾病或机能失调等。因此，需要开发出能测试这些微环境粘度的方法。

近年来，有一些文献报道了利用基于分子荧光转子的粘度探针来检测细胞内微环境粘度的方法。设计这种粘度探针主要有两种方法：一种是基于荧光寿命成像的方法，另一种是基于比例荧光系成像的方法。对于荧光寿命成像的方法，前人已经做了很优秀的工作。由于荧光寿命成像的发射波长只有单一的发射峰；根据A.Theodorakis小组的工作报道的要设计双波长的粘度分子转子有两种方法，一是基于光诱导分子内电荷转移(ICT)的方法，但是基于这种机理设计的探针容易受到溶剂的极性的影响，另一种方法就是设计基于荧光共振能量转的分子转子，这种方法存在的问题就是需要作为能量供体的发射光谱与能量受体的吸收光谱有较好的重叠交盖，这些要求限制了这类探针的设计与应用。

细胞内成像的精确可靠性十分重要，虽然Suhling等和Theodorakis等小组的工作分别是采用荧光寿命成像和比例的方法来达到检测粘度变化的目的，但是现有技术中还没有荧光探针具备上述两种性能。

经典的五甲川菁类荧光染料的合成是采用季铵盐与中间共轭链的缩合剂在醋酸酐做溶剂、无水醋酸钠作为催化剂、氩气保护条件下反应生成。一般的五甲川菁类荧光染料由于具有摩尔消光吸收大(达到10⁵数量级)等优点，在蛋白标记，DNA测序，离子中性小分子识别，细胞以及活体组织成像方面得到了很广泛的应用。而到目前为止还没有文献报道，五甲川菁染料用来设计成对环境粘度敏感的分子转子来检测溶液或者细胞内环境的粘度。

发明内容

在现有技术的基础上，本发明旨在提供一类新的五甲川菁荧光染料，该染料应当对环境粘度的变化具有很灵敏的响应，荧光性能受溶剂极性的影响很小，并且具有双重性能以保证其既适用于荧光寿命成像法，也适用于荧光比例法来检测环境粘度。发明人在研究中发现，在传统五甲川菁类荧光染料化合物的甲川链中间共轭连接取代基后，染料的光谱上出现两个峰。由于取代基的转动容易形成TICT激发态，消耗掉了激发能，使得染料主要以非辐射的形式回到基态。该类化合物排除了溶剂极性的影响，对环境粘度变化具有很灵敏的响应，当染料所处环境的粘度增加时，取代基的转动受到抑制，两个发射峰处的荧光强度呈现不同幅度增加，表现出比例变化，荧光寿命也增长，并且这两种变化与粘度的变化相关。据此，可以使用该类化合物在活细胞内成像来显示不同区域的粘度，或显示细胞内粘度的变化，具有很好的生物应用前景。

因此，本发明首先提供一类五甲川菁荧光染料，该化合物具有如下结构通式I：

其中：

X为CHO或CHCR₃R₄；

R₁和R₂各自独立选自(CH₂)_nR₇、(CH₂)_mOR₈、(CHR₉CH₂O)_pR₈或CH₂C₆H₄R₇；

R₃和R₄各自独立选自CN、COOH或COOR₁₆；