[发明专利]用于检测柠檬黄的方法及酶联免疫试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测柠檬黄的方法及酶联免疫试剂盒。

背景技术

柠檬黄色素是目前我国批准使用的六种食用合成色素之一，被广泛应用于食品、药品、化妆品、医疗器具、烟草、饲料、食用包装、日化品、玩具等领域。其分子结构为偶氮化合物，在体内代谢的产物为对人体具有潜在危害的芳香类化合物。因此，我国对在食品中的柠檬黄色素有严格限制。如果人们长期或一次性大量食用柠檬黄含量超标的食品，可能会引起过敏、腹泻等症状，当摄入量过大，超过肝脏负荷时，会在体内蓄积，对肾脏、肝脏产生一定伤害。目前，柠檬黄国家标准所采取的检测方法是薄层分析及分光光度计法，近年来，我国科研工作者在柠檬黄检测方面做了大量的工作，但都主要集中在理化检测方面，文献检索尚未发现关于柠檬黄的ELISA检测方法的报道，鉴于此，本发明研究和建立了柠檬黄的直接竞争ELISA检测方法。

发明内容

本发明的目的是针对现有柠檬黄检测产品中存在的不足，提供一种高特异性、高灵敏度、价格低廉、操作简单，能大批量快速检测柠檬黄的酶联免疫试剂盒。

本发明的另一目的是提供利用上述酶联免疫试剂盒检测柠檬黄残留的方法。

为了实现上述目的，本发明采用如下测定原理：首先将柠檬黄抗原包被于固相载体，例如酶标板上，然后加入标准品或待测样品，再加入酶标记柠檬黄抗体，包被抗原与标准品/待测样品中的柠檬黄竞争酶标抗体，待测样品柠檬黄含量高时，则与固相抗原结合的酶标抗体就少，反之结合在固相抗原上的酶标抗体就多，与固相抗原结合酶标抗体就越少，发色反应减弱，百分吸光度值低，反之，则发色反应增强，百分吸光度增高，以百分吸光度值为纵坐标，柠檬黄标准品浓度的半对数为横坐标作图即得标准曲线，再根据柠檬黄的标准曲线和待检样品的百分吸光度值，即可推算出待测样品中柠檬黄的浓度。

本发明的具体技术方案为：

提供一种检测柠檬黄的酶联免疫试剂盒，包括柠檬黄抗原和柠檬黄的特异性抗体；所述特异性抗体为柠檬黄的多克隆抗体或单克隆抗体。

提供一种柠檬黄残留的酶联免疫检测试剂盒，包含下列成分：

(1)包被了柠檬黄抗原的酶标板

(2)酶标记柠檬黄抗体工作液

(3)柠檬黄标准溶液

(4)底物显色液

(5)反应终止液

(6)浓缩洗涤液

(7)样品稀释浓缩液

所述酶标板采是96或40孔酶标板，酶标板孔内包被有能与抗柠檬黄抗体特异结合的柠檬黄抗原，所用的包被液为pH9.6、0.05mol/L的碳酸盐缓冲溶液，碳酸盐缓冲溶液含1～2g碳酸钠、2～4g碳酸氢钠和双蒸水1L，封闭液为pH7.4，含有5％山羊血清、10g/L酪蛋白的0.02mol/L磷酸盐缓冲液。

所述酶标记柠檬黄抗体工作液为采用过碘酸盐法将酶与柠檬黄抗体进行偶联得到的。所用标记酶可为辣根过氧化物酶或细菌提取碱性磷酸酯酶，本发明优选为辣根过氧化物酶，且采用改良后的过碘酸盐氧化法进行标记，提高了标记效率，节省了酶与抗体的用量，保证标记后酶与抗体具有良好的活性。

所述柠檬黄标准溶液的浓度为：0μg/mL、1μg/mL、3μg/mL、9μg/mL、27μg/mL、81μg/ml。

当标记酶为辣根过氧化物酶时，所述底物显色液为过氧化氢或过氧化脲、四甲基联苯胺硫酸盐混合溶液，所述终止液为1～2mol/L硫酸溶液或2mol/L的氢氧化钠溶液。

当标记酶为细菌提取的碱性磷酸酯酶时，所述底物显色液由底物液和底物缓冲液组成，底物液为对硝基磷酸盐缓冲液，底物缓冲液为含有过氧化氢或氧化脲的pH＝5.0磷酸-柠檬酸缓冲溶液，所述终止液为1～2mol/L硫酸溶液或2mol/L的氢氧化钠溶液。

所述浓缩洗涤液为含5％吐温-20的磷酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液pH＝7.4，浓度为0.1mol/L，为正常使用浓度的10倍。

所述样品稀释液为0.01mol/L磷酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液pH＝7.4。

其中，酶标记柠檬黄抗体是如下制备的：

将柠檬黄抗体与辣根过氧化物(HRP)采用过碘酸钠法进行偶联。

具体方法为：

a)溶解5mg HRP于1ml超纯水中，加入新配制的0.1mol/L多碘酸钠75μL，置室温或4℃冰箱反应20分钟或30分钟。

b)反应完后装入透析袋，0.001mol/L pH＝4.0醋酸缓冲液4℃透析过夜，期间按需更换透析液。