[发明专利]α-葡萄糖转苷酶

说明书

技术领域

本发明属酶工程或生物工程技术领域，具体涉及一种高转苷能力的α-葡萄糖转苷酶的制备方法。 

技术背景

α-葡萄糖转苷酶可以水解麦芽糖和麦芽低聚糖分子结构中α-1，4糖苷键，并将游离出来的一个葡萄糖残基转移到另一个葡萄糖分子或麦芽糖分子中的α-1，6位上，是低聚异麦芽糖生产中最关键的酶制剂。 

α-葡萄糖转苷酶是广泛存在于动植物及微生物体内的一类酶。目前除少数来源于部分植物和哺乳动物外，主要来自于微生物中。细菌、霉菌及酵母等某些菌株能分泌此酶，产酶较高的是黑曲霉(Aspergillus niger)和米曲霉(Aspergillus oryzae)。据调研，日本天野制药株式会社生产的α-葡萄糖转苷酶来源于黑曲霉，美国康奈尔大学Hung选用臭曲霉(A.fotidus NRRL 337)、台糖研究所选用碳黑曲霉(Acarbonarius CCRC 30414)、迁阪选用黑曲霉(ATCC 6257，ATCC 9642)等来生产α-葡萄糖转苷酶。调查表明，目前国内对α-葡萄糖转苷酶的研究主要集中在菌株的筛选以及反应条件的优化和酶学性质的研究方面，还未形成商品化的生产。 

从工业化来看，虽然我国异麦芽糖产量很高，但也存在两方面的不足：第一，α-葡萄糖转苷酶的用量很大，但因国内没有工业化，所以该酶完全依赖进口；第二，α-葡萄糖转苷酶在低聚异麦芽糖生产中，转化率较低，一般在50％以下。就连国外第一家酶制剂生产企业-日本天野制药株式会社，生产的α-葡萄糖转苷酶(α-transglusidase LAmano，简称TGLA)，据报道，用在低聚异麦芽糖生产中，转化率也仅有50％，必须通过后提取加工纯化的方法，才能得到高纯度的低聚异麦芽糖。 

本发明的目的在于提供一种高转苷能力的α-葡萄糖转苷酶的制备方法。用该方法制得的α-葡萄糖转苷酶粗酶液，用于低聚异麦芽糖生产的关键步骤—转苷阶段中，能明显提高反应速率，为整个生产过程缩短了反应时间，同时为企业降低了生产成本，产物中低聚异麦芽糖含量要远远高于已有的报道，也为后续的提纯工序节约了成本，解决了低聚异麦芽糖生产中得率低的问题。 

利用本发明制得的α-葡萄糖转苷酶有如下特征： 

1、pH稳定性：该酶在温度55℃，pH范围4.5-7.5时可稳定30min，最适pH6.5； 

2、热稳定性：该酶在pH值6.0条件下，分别以不同温度处理30min所得结果：55℃时该酶仍保留其初始活性的90％，而在70℃时则为70％。 

发明内容

为了解决低聚异麦芽糖生产中得率低的问题，本发明的目的在于提供一种高转苷能力的α-葡萄糖转苷酶的制备方法。 

为了实现上述目的，本发明的技术方案为：利用黑曲霉菌株(中国工业微生物菌种保藏管理中心保藏，保藏编号为2450)，经斜面培养、摇瓶扩培、液体深层发酵、及高速离心阶段，制得高转苷能力的α-葡萄糖转苷酶制剂，具体操作步骤如下： 

(1)斜面培养 

在装有察氏固体培养基的试管中接入黑曲霉菌株，30℃静置培养3-5d，制得孢子悬浮液； 

(2)摇瓶扩大培养 

在装有PDY培养基的摇瓶中接入斜面孢子悬浮液，在28-32℃、80-150r/min条件下培养，得摇瓶孢子悬浮液； 

(3)液体深层发酵 

按5-10％摇瓶孢子悬浮液的量接种于经高压灭菌后的液体发酵培养基进行培养； 

其中：菌种复壮中所述黑曲霉孢子悬浮液的制备是将培养基上的黑曲霉孢子用无菌水洗下制得；所述的发酵培养基的配方由蔗糖5-12％，蛋白胨2-8％，酵母提取物0.1-0.5％，K₂HPO₄ 0.1-1％，N-甲基-D-葡萄糖胺0.01-0.05％，NaCl 0.1-1％，MgSO₄ 0.01-0.05％，其余水分，经混合均匀制得；所述摇瓶发酵温度在28-35℃，100-160r/min。 

(4)发酵液经高速离心，取上清液得α-葡萄糖转苷酶粗酶液。 

附图说明

说明书附图为低聚异麦芽糖生产的工艺流程图。

具体实施方式

实施例1