[发明专利]一种可抑制转基因产物所致免疫反应的基因治疗药物及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子药物学、分子医学和疾病防治领域，具体涉及基于重组腺相关病毒(rAAV，)基因治疗药物，尤其是一种可抑制转基因产物所致免疫反应的基因治疗药物及其制备方法，该药物可有效抑制由于转基因产物导致的免疫反应的产生。

背景技术

基因治疗为治疗单基因缺陷引起的疾病提供了一个似乎完美的解决方案，但始于1990年的基因治疗临床研究一直面临各种技术挑战和重重困难，其中包括一位受试者在临床试验中死亡。随着几种重大疾病基因治疗的成功，基因治疗取得了重大突破，因而被Science杂志评为2009年十大科学进展之一[Alberts B.Science，2009，326(5960)：p1589]。成功的案例就包括应用重组腺相关病毒(rAAV)基因药物成功治愈Leber’s先天性黑内障的临床研究结果。

长期以来，大家一致认为rAAV基因药物具有无致病性、低免疫原性、能介导外源基因长期表达和宿主范围广泛等优点，是最有发展前景的基因治疗载体。在小鼠、大鼠、狗和非人灵长类动物体内进行的大量rAAV基因药物的临床前研究也从未发现由淋巴细胞介导的适应性免疫反应。但由美国宾州大学High教授主持进行的治疗血友病的I/II期临床研究却发生了严重的细胞免疫反应，病人转氨酶水平急剧升高，肝功能受到严重损害，该临床研究被迫终止[Manno CS，et al.Nat Med，2006，12：p342-347.]。该研究结果再次敲响了安全性的警钟。rAAV基因药物在人体内诱发的细胞免疫反应，很有可能就此终结其临床应用的可能性。

抗原在细胞内的加工递呈一般按照经典途径进行：内源性蛋白被加工为抗原肽后荷肽于MHC-I类分子，以pMHC-I的形式转运并递呈至细胞表面，即MHC-I类途径；外源性输入蛋白的抗原肽则荷肽于MHC-II类分子，即MHC-II类途径。非经典途径也称为交叉递呈途径，即外源性抗原通过MHC-I类分子递呈，而内源性抗原通过MHCI-II分子递呈，一般认为该途径的应用较为罕见，且主要发生在树突细胞(DC)。在构建rAAV基因药物时，已经剔除了与其衣壳蛋白编码和加工有关的所有病毒基因，rAAV在靶细胞内仅表达转基因，不应当再表达衣壳蛋白，所以按照经典途径难以解释AAV衣壳蛋白抗原的递呈。Mingozzi等认为在人体内，任何有核细胞均可通过非经典递呈途径处理外源性蛋白并递呈至细胞表面，然后激活记忆性T细胞[Mingozzi F，et al.Nat Med，2007，13：p 419-422.]。Pien等采用可溶性T细胞受体(TCR)多聚体技术，首次观察到在肝细胞表面递呈的rAAV衣壳蛋白pMHC-I，为外源性输入rAAV抗原的交叉递呈提供了直接的证据[Pien GC，et al.J Clin Invest，2009，119：p1688-1695.]。但在小鼠体内进行的实验表明经转基因手段内源性表达AAV衣壳蛋白的肝细胞可以激活CTL并被裂解，而外源性输入的rAAV衣壳蛋白虽可能以交叉递呈途径激活CTL，但不足以引起细胞的裂解，说明即使存在非经典途径递呈抗原，其加工和递呈抗原肽的效率也明显低于经典途径。

如何避免rAAV基因药物在临床应用中可能发生的免疫毒性，成为研究人员奋斗的目标。目前提出的解决方案包括免疫调节、载体优化和提高药物纯度等几个方面[刁勇等.药学学报，2010.45(9)：p1071-1077]。许瑞安等曾发明了一种用于基因治疗rAAV载体，可以在肝和造血细胞特异性抑制病毒衣壳蛋白复制，从而抑制AAV病毒衣壳蛋白引起的细胞免疫毒性[许瑞安等.一种用于基因治疗的新型细胞特异性内含microRNA结合序列的基因HAAVmir.200910136134.5]。但rAAV载体转导靶细胞后由转基因产物引起的细胞免疫反应仍没有可行的解决方案。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种可抑制转基因产物所致免疫反应的基因治疗药物及其制备方法。本发明从解决目前尚无办法的由rAAV载体的转基因产物引起的细胞免疫反应为目标，采用MicroRNA靶向沉默特定细胞内的转基因表达的技术方法，该载体不仅能有效地在体内表达转基因，并且能抑制由rAAV载体的转基因产物引起的细胞免疫反应，为基于rAAV载体的基因药物的安全性提供了保障。

为了达成上述目的，本发明的解决方案是：

一种可抑制转基因产物所致免疫反应的基因治疗药物，该基因药物载体质粒的转基因表达框的3′-UTR区含有miR-155的结合序列，其碱基序列为CCCCTATCACAATTAGCATTAA。