[发明专利]城市垃圾堆肥微生物组分的提取方法

权利要求书

1.一种从生活垃圾堆肥原液中提取微生物组分的方法，它是将城市垃圾堆肥在含高氏Gause一号培养基、马铃薯葡萄糖培养基、牛肉膏蛋白胨培养基的固体培养基中分别培养分离，分离后的纯菌种接种到液体培养基中进行增殖培养，从而鉴定堆肥中有效微生物的组成，其特征在于按如下的步骤进行：

（1）配制固体培养基:烧杯中加一定量的蒸馏水、去离子水或自来水，按配方称取营养成分，加入浓度为0.1g/L EDTA；待全部营养成分配齐后，用质量浓度为100g/L的NaOH或质量浓度为100g/L的HCl调节pH 4.5-7.2，然后加入缓冲剂，分装，置高压蒸汽灭菌锅内灭菌，冷却备用；

（2）菌种分离培养：

  1)到平板： 每种培养基倒入3个皿中；

  2)制备堆肥稀释液：称取新鲜堆肥10克，放入盛90ml无菌水，振摇约20min，制成10^-1- 10^-6稀释度的堆肥溶液；

 3)涂布：将上述每种培养基的平板底部或培养基周边用记号笔分别写上10^-4，10^-5，和10^-6 3种稀释度字样，每种培养基每稀释度标记3皿，然后用灭过菌的量程为20~200ul的移液枪分别由10^-4，10^-5和10^-6 3管堆肥稀释液中吸取适量对号放入已写好稀释度的平板中央位置，每皿放入0.2ml，用无菌玻璃涂棒，在培养基表面皿轻轻地涂布均匀，室温下静置5~10min；

  4）培养：将含高氏Gause一号培养基的平板倒置于28℃温室下培养5~7天，马铃薯葡萄糖培养基的平板倒置于28℃温室下培养3~5天，牛肉膏蛋白胨平板倒置于37℃温室中培养1~2天；

（3）配制液体培养基：

1)牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏1.25g；蛋白胨2.5g；NaCl1.25g；水250 m；PH 7.0~7.2，0.1MPa灭菌20min；

2）马铃薯葡萄糖培养基：马铃薯40g，葡萄糖4g，水200mL，自然pH，0.1MPa灭菌20分钟；

3)高氏合成一号培养基：可溶性淀粉 4g；硝酸钾 0.2g；氯化钠0.1g；三水合磷酸氢二钾0.1g；七水合硫酸镁0.1g；七水合硫酸亚铁0.002g；琼脂4g加入5%的酚溶液2滴，蒸馏水200ml；pH7.2~7.4，0.1MPa灭菌20分钟；

（4）接种纯菌种：用灼烧过的接种环取菌种，先将接种环接触一下没长菌的培养基部分，使其冷却以免烫死菌种，然后用接种环轻轻取菌少许，将取有菌种的接种环送入液体培养基中，并使接种环在液体与瓶壁接触的部位轻轻摩擦，使菌体分散于液体中，接种后塞上棉塞，使液体培养基轻轻摇动，使菌体均匀分布于培养基中，以利生长；

（5）菌种的增值培养：将液体培养基放入旋转式摇床进行微生物振荡培养，固定在摇床上的锥形瓶随摇床以200-250r/min的速度运动，由此带动培养物围绕着锥形瓶内壁平稳转动，摇床恒温30℃，培养24~48h后，各培养基变混浊，表明各菌种已在培养基中生长，置于冰箱中保存，得出堆肥微生物的组成菌种。

2.权利要求1所述提取微生物组分的方法，其中的固体培养基为：

（1）牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏5.0g；蛋白胨10g；NaCL 5g；琼脂20g；水1000ml；PH 7.0-7.2，0.1MPa灭菌20min；

  （2）马铃薯葡萄糖(PDA)培养基：马铃薯 200g；葡萄糖（蔗糖）20g；琼脂15-20g；水1000ml；PH自然，0.1MPa灭菌20min；

  （3）高氏合成一号培养基：可溶性淀粉 20g；硝酸钾 1g；氯化钠0.5g；三水合磷酸氢二钾0.5g；七水合硫酸镁0.5g；七水合硫酸亚铁0.01g；琼脂20g，蒸馏水1000ml；pH7.2-7.4，0.1MPa灭菌20min。

3.权利要求1所述提取微生物组分的方法，其中所述的缓冲剂为：K₂HPO₄ 、KH₂PO₄、Na₂CO₃、NaHCO₃或NaOH。

4.权利要求1所述提取微生物组分的方法，其中所述的10^-1- 10^-6稀释度的堆肥溶液在测定：

    A．细菌数量时，采用10^-4，10^-5，10^-6稀释度；

    B．放线菌数量时，采用10^-3，10^-4，10^-5稀释度；

C．真菌数量时，采用10^-2，10^-3，10^-4稀释度。