[发明专利]一种获得转基因海岛棉的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种农杆菌介导的喷花法转化海岛棉的方法。

背景技术

目前海岛棉基因转化工作主要集中在建立高频率、稳定、简便可重复的植株再生体系及花粉管通道法两种，但是海岛棉愈伤诱导及转化相对比较困难，对基因型要求很高，再生频率较其他植物而言相对较低，很难突破。而花粉管通道转化方法落铃率较高育种影响转化频率，建立一种简单易行，操作方便的海岛棉转基因方法势在必行。

发明内容

本发明的目的在于提供一种农杆菌介导的海岛棉花粉管转化新方法，本发明简单易行，操作方便，无需复杂的实验仪器，工作量较小，转化频率较高，可加快海岛棉的基因工程育种进度。

本发明的技术方法如下：

一种获得转基因海岛棉的方法，包括以下步骤：构建植物表达载体，将构建好的表达载体转化农杆菌，挑取阳性克隆，在YEB培养基上摇菌，待菌液浓度达到1.2-1.6时，收集菌体，在收集的菌体中加入渗透培养基，混匀得到农杆菌悬浮液；将所述农杆菌悬浮液对刚展开的海岛棉花朵进行喷雾，喷雾后用套管套住该花朵，并做好标记，生育期结束收获转化种子，进入下一代种植，种植的F1代幼苗在3叶期时进行卡那霉素或除草剂检测；筛选不变色的植株进行PCR检测，获得转化阳性的F1代植株，进行Southern检测，所有阳性苗留种，种植并获得纯化转基因株系。

所述的获得转基因海岛棉的方法，所述渗透培养基：1/2MS+20％蔗糖+0.1‰(v/v)Selwet+0.1‰(v/v)DMSO。

所述的获得转基因海岛棉的方法，所述收集菌体的方法为：室温下5000rpm离心5min，弃上清液，将农杆菌沉淀悬浮于10mlYEB液体中，置于冰盒保存。

所述的获得转基因海岛棉的方法，将构建好的表达载体转化农杆菌GV3101或EHA105。

所述的获得转基因海岛棉的方法，所述植物表达载体具有较好的选择标记或抗性标记，使后代植株容易进行实验室及田间筛选。

所述的获得转基因海岛棉的方法，将转化的菌株在液体YEB培养基250rpm摇菌，带到OD值达到1.2时，收集菌体，并放置于4℃，保证菌液活力。

所述的获得转基因海岛棉的方法，将所述农杆菌悬浮液注入400ml喷壶中，选取刚展开的花朵喷雾，到花上有水珠滴下时为止，喷雾后用套管盖住花，用色彩鲜艳的毛线做好标记。

该方法操作简单，不受基因型限制，转化效率较高，减轻了工作量，将会促进海岛棉基因转化研究，加快分子育种进程。目前，还未见有关海岛棉农杆菌侵染法转化的报道。

附图说明

图1、转EPSPS基因后代PCR检测；M表示Marker，+表示阳性对照，1-32表示不同转基因后代单株，-表示非转基因阴性对照

图2、转基因后代Southern检测；+：表示质粒，1-7：表示不同转基因后代株系，-：表示非转基因对照。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。

1、取保藏的除草剂基因EPSPS的农杆菌菌液划线，再次PCR检测，挑取阳性单菌落，接种于5ml相应抗性的YEB中，28℃，230rpm过夜。

2、次日，将4ml菌液转入400ml相应抗性的YEB培养基，继续培养，使菌液的0D值达到1.2到1.6之间。

3、室温下5000rpm离心5min，弃上清液，将农杆菌沉淀悬浮于10mlYEB液体中，置于冰盒保存。

4、将上述菌液加入1/2MS+20％蔗糖+40μl Selwet+40μlDMSO的渗透培养基中，渗透培养基总量为400ml，使OD值大约在0.6左右。

5、将混合好的农杆菌悬浮液注入400ml喷壶中，以海岛棉新海21、新海25、新海32为受体，选取刚展开的花朵进行喷雾，到植株上有水珠滴下时为止，喷雾后用纸帽盖住花，用色彩鲜艳的毛线做好标记。统计喷花数量及坐铃率，如表1所示。

表1 不同海岛棉品种喷雾侵染花数及坐铃率

6、种子成熟后收获T₁代种子，加代筛选，播种密度可以大一些，但每穴播种量不要超过两粒。

7、待达到两叶一心，用1％的卡那霉素涂抹叶片，5天一次，共三次，筛选不变色的植株，将叶片不变色的植株做标记，拔去两边棉苗，确保通风。

8、叶片不变色的植株取样进行PCR检测(图1)，如能扩增出目的基因的条带即为转化成功单株。

9、统计转化频率及PCR阳性植株，如下表2所示，不同海岛棉品种均获得了转EPSPS基因的植株。