[发明专利]一种日本血吸虫23kDa膜蛋白大亲水肽段融合蛋白及其在血吸虫感染免疫诊断中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种日本血吸虫23kDa膜蛋白大亲水肽段融合蛋白抗原制备及基于免疫印渍方法对血吸虫感染进行早期诊断的试剂盒及检测方法，属于寄生虫病免疫诊断技术领域。

背景技术

血吸虫病是严重危害我国及世界上热带与亚热带地区人民身体健康的严重公共卫生问题。中国仍有449个县有血吸虫病流行，近44万血吸虫病人，约2.3亿人口受到血吸虫感染的威胁。对血吸虫感染的病人、家畜、野生动物等传染源进行诊断，及时给予治疗，消灭传染源，阻断血吸虫病的传播是血吸虫病防治的关键措施。血吸虫感染诊断常用技术包括如下几种：

病原学检测

采用KATO-KATZ法检测血吸虫感染病人粪便中的血吸虫虫卵，或通过毛蚴孵化法检测粪便样本中是否有虫卵并能孵化出血吸虫幼虫毛蚴。病原学诊断是血吸虫感染诊断的金标准，缺点是必须是在血吸虫在宿主体内发育成熟产卵后并排出体外之后才能做出诊断，时间上滞后，不能进行早期诊断。该方法操作烦琐，不易被接受，容易漏诊。

核酸检测

采用DNA探针杂交，聚合酶链反应（PCR）或环介导同温DNA扩增技术（LAMP法）检测血吸虫感染病人、动物血清样本，粪便样本中的血吸虫特异性DNA片段，来确定宿主体内是否有血吸虫感染。此类方法的检测效果与病原学检测效果相似，具有血吸虫活动性感染的诊断价值, 缺点是操作烦琐，成本高，难以在血吸虫病防治基层机构推广应用。

免疫学检测

免疫学检测方法包括皮试、循环抗原检测和血清抗体检测三类方法。

皮试：是将血吸虫成虫抗原接种到人体的皮内，通过观察其在一定时间范围内的致敏效果来判断受试者是否感染血吸虫。该方法的特点是操作简便，在20世纪60-80年代被广泛用于血吸虫病的筛查，缺点是对人体有损害和副作用，结果特异性差，并受到受试者的遗传及身体状况的影响，目前该方法已被弃用。

循环抗原检测：循环抗原是指进入宿主血液循环的血吸虫虫体蛋白成分，是体内存在血吸虫的标志，检测血吸虫的循环抗原具有病原学诊断价值。该方法的建立必须制备抗循环抗原的特异性单克隆抗体，建立以单克隆抗体检测循环抗原酶联免疫学方法或其它检测方法。由于目前对血吸虫循环抗原的成分不清楚，难以获得非常好的特异性单克隆抗体，虽然国内外均报道了一些血吸虫循环抗原的检测方法，但是敏感性都比较低，不能满足现场血吸虫感染查病的需要。

循环抗体的检测：循环抗体是指血吸虫进入人体后其抗原成分刺激机体的免疫系统产物的抗血吸虫循环抗原特异性抗体，特异性抗体的出现一般在血吸虫感染宿主后1-2周，出现比较早，有早期诊断价值。针对某些特定抗原的抗体在治疗后能快速转阴，具有疗效考核价值。常用检测抗体的方法有很多，包括：酶联免疫吸附法（ELISA），免疫层析法（试纸条法），免疫渗滤法，间接血凝法（IHA），环卵沉淀法（COPT）, 免疫磁珠法等。它们的共同特点是以血吸虫的抗原与被试者血清进行反应，观察被试者体内是否有抗血吸虫抗原的特异性抗体存在。其共同的缺点是所用的抗原均为血吸虫可溶性虫卵抗原或成虫抗原，这种抗原为混合抗原。由于虫卵或成虫可溶性抗原的成分十分复杂，有一些成分可能与其它物种的成分有同源性，易与其它寄生虫感染血清发生交叉反应，产生假阳性结果。使用重组血吸虫抗原理论上可以避免上述交叉反应的产生，但是由于重组血吸虫抗原多数是从大肠杆菌中制备，纯化的重组血吸虫抗原难免会混杂有大肠杆菌抗原成分，而大肠杆菌是人体及动物的体内的正常菌群，因而会引起假阳性结果。交叉反应与假阳性问题是当前抗体检测所必须解决的问题。

循环抗体检测的另一方法就是免疫印渍法。它的原理是采用聚丙烯凝胶电泳能按分子量的大小将混合抗原各种成分分开，形成分子量大小不同的蛋白质条带，将这些蛋白质条带通过电转移方法转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，再与血吸虫感染患者血清反应，通过观察血吸虫抗原蛋白条带是否与受试者血清发生反应即可判断受试者是否感染过血吸虫。该方法的特点是特异性好，不易产生交叉反应及假阳性结果；敏感性高于常规酶联免疫吸附方法；如果使用血吸虫童虫期的抗原作为检测抗原，则具有早期诊断价值。

发明内容

本发明目的是提供一种以重组融合蛋白为检测抗原检测宿主血清中抗日本血吸虫23kDa膜蛋白分子特异性抗体IgG或IgM免疫印渍方法，可以解决当前血吸虫抗体检测方法特异性和早期诊断价值不足的问题。

本发明的技术方案：为达到上述目的，本发明选择日本血吸虫23kDa膜蛋白分子的大亲水肽段与人血清白蛋白的融合蛋白，记为Sj23HD-HSA融合蛋白，作为抗血吸虫抗原特异性抗体的检测抗原。