[发明专利]一种双歧杆菌多糖分离纯化的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种应用生物工程技术从双歧杆菌菌体中分离纯化双歧杆菌多糖的方法。

背景技术

双歧杆菌(Bifidobacterium)最初由法国科学家Tissier于1899年从婴儿粪便中分离得到。在细菌分类学中双歧杆菌属为革兰氏阳性专性厌氧细菌，典型的菌体形态应呈Y字或V字的分叉杆菌，但大多数菌体呈多样形。与其他革兰氏阳性菌相比，它对营养的要求不十分严格，最适pH 6.5～7.0，最适生长温度37℃～42℃。该菌无芽胞、荚膜及鞭毛，无运动性，触媒、硝酸盐还原、靛基质产生、明胶液化及精氨酸水解均阴性。到目前为止已发现32种型的双歧杆菌，除人以外还在马、牛、猪、鸡、鱼、甚至蜜蜂等动物体内都分离到不同种型的双歧杆菌，其中有12种是从人体中分离来的，1974年伯杰细菌鉴定手册第八版正式确定其为双歧杆菌属。应用于食用益生菌生产的有婴儿双歧杆菌(B.infantis)、长双歧杆菌(B.longgums)、短双歧杆菌(B.breve)、青春双歧杆菌(B.adolescentis)、两歧双歧杆菌(B.bifidum)。作为益生菌它们被广泛添加在食品、药品、保健品中，用于人体的防病，治病。

随着人类对双歧杆菌认识的深入，应用双歧杆菌自身的生物拮抗作用和免疫作用以抑制肠道有害菌的生长，从而达到防病治病的作用。近年来，人们注意到肠道内双歧杆菌可增强机体免疫监视功能，例如：通过口服双歧杆菌可增强各种细胞因子和IgA产生。提高自然杀伤细胞和巨噬细胞活性、提高局部或全身的防御功能，发挥自身稳定调节、抗感染、抗肿瘤、抗突变、抗衰老作用。

经检索，关于双歧杆菌多糖的分离纯化方法目前尚无报道。

发明内容

本发明要解决的问题是提供一种双歧杆菌多糖的分离纯化的方法。

本发明提供双歧杆菌多糖的分离纯化方法，不影响多糖天然的结构，保留了其生物活性，并能作为(如针剂等)药用原料。

本方法的具体步骤是从双歧杆菌菌体中通过热水提取有生物活性的粗多糖、去蛋白、除盐、柱层析纯化和冷冻干燥。本发明具体工艺步骤如下：

1、双歧杆菌发酵其菌体浓缩：本发明所涉及到的双歧杆菌包括青春型双歧杆菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌、两歧双歧杆菌、婴儿双歧杆菌。将双歧杆菌种子液接入已经灭菌后的每100ml培养基中含有：大豆蛋白胨1-1.5g，鱼胨1-1.5g，葡萄糖2g，牛肉膏0.5-2g，酵母膏0.5-2g，K₂HPO₄ 0.2-0.6g。经35-38℃厌氧发酵后，再经离心浓缩即获得双歧杆菌菌体浓缩物。

2、细胞破壁：将该双歧杆菌菌体浓缩物加蒸馏水或生理盐水(1∶3-1∶5)，使用高压细胞破碎机操作压力100MPa左右以高压破碎菌体细胞壁。

3、脱脂：取破壁粉碎的双歧杆菌菌体粉末倒入1000ml烧杯中，加入甲醇，搅拌至完全浸没，室温下脱脂24h。黄褐色上清回收，沉渣再加入甲醇，重复脱脂一次。

4、水提：步骤1所得的脱脂后双歧杆菌菌体粉末按1∶6％(g/ml)的料液比加入蒸馏水，室温下、pH＝7条件下提取2.5h。混合物用50ml塑料离心管，以5000rpm，15min离心，上清45℃旋转蒸发器减压蒸发，浓缩至原生药体积的1.5倍，再逐渐加入预冷的4倍体积的无水乙醇，4℃冰箱过夜。收集沉淀，即得双歧杆菌粗多糖。

5、去蛋白：步骤2所得的双歧杆菌多糖水提物溶液用有机溶剂以常规方式去除其蛋白；

6、透析：步骤3所得的水提物浓缩，离心，弃不溶物，得上清液，用透析袋将上清液在流水中透析48小时，再在去离子水中透析24小时，进一步去除寡糖、无机盐、色素等小分子杂质，收集双歧杆菌多糖的提取液。

7、纯化：将经步骤4透析后的液体浓缩，以DEAE纤维素-52和葡聚糖凝胶层析。

a)离子交换色谱柱(DEAE纤维素-52)：蒸馏水平衡DEAE纤维素-52(3.5×40cm)，上样量30ml，以0～0.5mol/L的NaHCO₃梯度洗脱，流速为0.5ml/min，苯酚-硫酸法检测多糖出峰，绘制洗脱曲线。分离出5个组分，收集后适当浓缩、再透析和冷冻干燥。