[发明专利]完整叶绿体长时间离体培养方法

说明书

【技术领域】：

本发明属于植物基因工程技术领域，主要涉及植物完整叶绿体分离与体外培养的技术与实施，包括叶绿体分离与体外培养试剂的配制和所涉及的操作程序。

【背景技术】：

叶绿体是植物将太阳能转化成化学能的重要细胞器，是地球生物维持生存的主要摄取能量的源头，因此，叶绿体的结构、功能、基因组及基因表达调控等都成为生命科学备受关注的问题，其相关的基础理论和应用研究与粮食、能源、环境等人类的生存密切相关。处于真核生物细胞中的叶绿体虽然拥有独立的基因组和双层生物膜包被，但属于半自主性细胞器，其发生、发育和功能不仅受细胞核基因组的调控，还与其它细胞器相互影响，协同作用。对叶绿体突变和遗传转化后的细胞形态学变化等等的观察，可以为叶绿体基因组及基因表达调控研究提供重要方法。目前，国际上外源基因导入叶绿体的技术仍局限于主要的基因枪方法，叶绿体突变体和转化子筛选依然比较困难，这些成为制约叶绿体转化等相关研究与应用发展进程的关键瓶颈，而叶绿体离体操作是一个重要的突破口，离体叶绿体若能较长时间保持完整，将为叶绿体基因工程操作提供便捷和开辟新途径。

【发明内容】：

本发明的目的是提供完整叶绿体提取与叶绿体体外长时间培养相关试剂及其提取及培养方法。

本发明提供的完整叶绿体提取相关试剂组成包括：

以上各种试剂分别溶于无离子水中，高压灭菌后于4℃冰箱单独保存。

本发明提供的完整叶绿体离体培养相关试剂组成包括下列表明浓度的组成成分：

EDTA(PH8.0)    2mM

MnCl₂          1mM

MgSO₄          1mM

NaCl           10mM

MES    50mM

山梨醇 0.3M；

以上试剂溶于无离子水中，调pH至6.2，高压灭菌后于4℃冰箱保存。

本发明所述的完整叶绿体提取与长时间离体培养方法的具体步骤包括：

第1、称取4℃过夜的新鲜植物子叶8～10g，剪碎，置于冰上预冷的研钵中；

第2、将所述提取试剂中的BufferA40ml分两次加入研钵中，并加入1g石英砂，研磨后经6层纱布过滤至50ml离心管中；

第3、将第2步中的研磨液于4℃800g离心6min，弃上清；

第4、向第3步中加入预冷的所述提取试剂中的BufferB 25ml，然后加入17.5ul β-巯基乙醇，悬浮叶绿体；

第5、将第4步中的悬浮液于4℃800g离心8min，弃上清；

第6、向第5步中加入所述提取试剂中的BufferC 12ml，悬浮叶绿体；

第7、将第6步中的悬浮液于4℃1000g离心8min，弃上清，获得完整叶绿体；

第8、取10ml所述离体培养试剂悬浮第7步获得的完整叶绿体，置于25℃下避光或弱光(长时间离体)培养。

本发明的优点和有益效果：

本发明以黄瓜、烟草为主要实验材料，建立了适合于高等植物叶绿体功能研究的体外培养技术，利用这种操作技术不仅使离体叶绿体体外培养达到20天左右，突破了国际上最长只有10天左右的报道时间，而且经过叶绿体显微形态学观察、生物膜结构完整性鉴定和记录完整叶绿体的数量等方法，证明经过长时间离体培养状态下的叶绿体显微形态正常且结构保持完整。由于叶绿体是植物进行光合作用将太阳能转变成生物能的场所，是地球生物维持生命活动的主要能量合成源头，因此叶绿体功能及应用领域的相关研究一直倍受人们的关注。在新世纪人类仍然被粮食短缺、环境污染和能源匮乏等等问题所困扰，因此，人们再次将目光聚焦到绿色植物及其代表的叶绿体上，叶绿体基因组及基因表达研究也成为近些年生命科学研究的一个新热点。对离体叶绿体进行相关基础理论与应用研究有省时、易于操作、观察和检测方便等优点，所以，本发明为叶绿体功能、叶绿体遗传转化以及细胞工程操作提供了极其重要的技术平台。

【附图说明】：

图1为分离后尚未进行培养的离体叶绿体(2000倍放大)。

图2为离体培养后叶绿体的显微形态观察(1500倍放大)，其中A～C分别为培养5天、11天和18天。

图3为对离体培养叶绿体进行台盼兰染色检测其膜完整性(1000倍放大)，A～C分别为培养0天、2天和12天。

图4为在黑暗条件下对离体培养不同时间的叶绿体进行的计数。

图5为离体叶绿体内基因扩增检测图，A为培养11天，B为培养20天。