[发明专利]增强的启动子以及使用该启动子产生L-赖氨酸的方法

说明书

技术领域

本发明涉及增强的启动子以及使用该启动子产生L-赖氨酸的方法。

背景技术

棒状细菌是广泛应用于生产氨基酸和各种核酸的工业微生物。棒状细菌为革兰氏阳性细菌，用于生产在动物饲料、药物、食品加工等领域具有多种工业应用的化学物质，包括诸如L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-精氨酸和谷氨酸的氨基酸和各种核酸，棒状细菌的生长需要生物素。棒状细菌的特征为劈裂(snapping division)并且很少降解所产生的代谢物。这类棒状细菌的实例为：棒状细菌属，包括谷氨酸棒状细菌(Corynebacteriumglutamicum)；短杆菌属包括黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)；节杆菌属种(Arthrobacter sp.)和微杆菌属种(Microbacterium sp.)。

作为L-氨基酸的一种，L-赖氨酸在商业上用作动物饲料添加剂，因为它能够通过增加其他氨基酸的吸收而改善饲料的质量；L-赖氨酸还用在人类的药物中，特别是作为输注溶液的成分；它还用于制药工业。因此，赖氨酸的工业生产已经成为经济上重要的工业过程。

为了改进赖氨酸生产的效率，已经通过扩增赖氨酸合成途径中的个体基因或修饰它们的启动子以提高生物合成途径中的酶促活性。锚定有参与赖氨酸生物合成途径的增强的基因的棒杆菌菌株以及生产赖氨酸的方法在本领域中是公知的。例如，美国专利第6,746,855号公开了具有增强的lysE基因(赖氨酸输出载体基因)的棒杆菌菌株，在该菌株中还额外导入了选自dap A基因、lysC基因、pyc基因和dapB基因的基因，该文献还公开了通过培养所述菌株产生赖氨酸的方法。此外，美国专利第6,221,636号公开了带有重组DNA的棒状细菌，所述重组DNA包含编码天冬氨酸激酶的DNA序列(其中L-赖氨酸和L-苏氨酸的反馈抑制活性被基本脱敏化)和编码二氨基庚酸脱羧酶的DNA序列。美国专利申请第20060003424号公开了使用棒状细菌产生L-氨基酸的方法，所述棒状细菌通过对GDH基因、CS基因、ICDH基因、pDH基因或产生ACO的基因的启动子进行修饰以使其接近共有序列，从而具有改进的酶促活性。

为了通过基因工程或代谢工程方法从这类棒状细菌开发高效价的菌株，应该在棒状细菌中选择性地调节参与几种代谢途径的基因的表达。为此目的，重要的是调节启动子的活性，启动子是调节区域，它负责募集RNA聚合酶而启动DNA分子的转录。

迄今为止，并没有通过改进天冬氨酸氨基转移酶(EC；2.6.1.1；aspB)基因的启动子而使棒状细菌具有高表达水平的报道，天冬氨酸氨基转移酶(EC；2.6.1.1；aspB)被认为在为赖氨酸生物合成途径提供赖氨酸前体——天冬氨酸的过程中起重要作用。

发明内容

技术问题

因此，本发明人致力于通过改进aspB基因的启动子来提高表达水平。最终，他们提供了属于棒杆菌属(Corynebacterium)的微生物，通过碱基置换改进在棒杆菌属染色体上的aspB启动子并导入所述改进的启动子，使得所述微生物的天冬氨酸氨基转移酶活性高于其内源性活性，由此完成了本发明。

技术方案

本发明的目的是提供具有增强的启动子活性的核酸分子，所述核酸分子来源于谷氨酸棒杆菌。

本发明的另一目的是提供包含所述具有增强的启动子活性的核酸分子的载体。

本发明的仍然另一目的是提供被所述载体转化的转化子。

本发明的仍然另一目的是提供产生赖氨酸的方法，所述方法包括培养所述转化子的步骤。

有益效果

本发明的具有增强的启动子活性的核酸分子与aspB基因可操作地连接并且来源于谷氨酸棒杆菌，表现出比野生型更高的启动子活性，并且因此改进了天冬氨酸氨基转移酶活性，由此提高了赖氨酸的生产效率。

附图说明

图1显示的是用于插入至棒杆菌染色体中的载体pDZ；

图2显示的是用于将碱基置换入棒杆菌中的载体pDZ-aspBP1；

图3显示的是用于将碱基置换入棒杆菌中的载体pDZ-aspBP2；和

图4显示的是用于将碱基置换入棒杆菌中的载体pDZ-aspBP3。

最佳方式

在为实现上述目的的一个方面中，本发明涉及具有增强的启动子活性的核酸分子，所述核酸分子具有选自SEQ ID NO：2、3和4中任一种的碱基序列。

在一个优选实施方案中，所述碱基序列可与编码天冬氨酸氨基转移酶的基因可操作地连接，并且可以来源于棒杆菌属。