[发明专利]一种血液RNA表面增强拉曼光谱检测方法

说明书

技术领域

本发明涉一种血液RNA表面增强拉曼光谱的检测方法，更具体的说是从人的血液中提取RNA分子，滴加于银纳米薄膜上，然后通过表面增强拉曼光谱来检测RNA分子的拉曼(SERS)光谱信号，属于生物医学光学技术在生命科学中的应用领域。

背景技术：

理想的癌症早期筛查试验要求高灵敏度，高特异性，快速及低损伤的检验效果，才能有效的阻止癌症的继续发展和减少癌症的死亡率。但是目前没有一种方法能符合这种理想的筛选技术。如用于检测结肠癌的常用的方法有乙状结肠镜，钡灌肠，全结肠镜检查等，虽然灵敏度和特异性相对较高，但这些检查是侵入性的，而且费用较高。与之相比，粪便隐血试验是一种无损伤的检测，但这种方法既不灵敏也不特异。因此，为了克服这些局限性，需要寻求一种简单，准确，安全及快速的方法来检测癌症，不仅能为临床医生提供迅速和客观的诊断信息，也会大大地提高患者的生存率。

自1948年由Mandel和Metais发现循环核酸以来，越来越多的科学家致力于循环核酸的研究，循环核酸对于肿瘤的早期发现，诊断以及治疗具有重要的价值，为非侵入性肿瘤检测提供了可能性。肿瘤标志物mRNA检测是目前循环核酸领域研究最多且最深入的。近年来，新发现的miRNA是一类内源性非蛋白质编码的RNA分子，与癌症的发生发展有着重要的关系，研究表明在结肠癌组织和血清中的特异性miRNA可用于筛查结肠癌，以及动态监测预癌症的复发。

自从Fleischmann等人发现表面增强拉曼散射现象以来，表面增强拉曼散射已经成为分子吸收、单分子检测等最为灵敏的检测技术之一。许多超低浓度的分析物，包括化学、生物和医学分子均可以通过SERS检测出来。当目标分子吸附在银或者金的纳米结构上时，非共振的拉曼信号会被增强到10¹⁴倍。如今SERS光谱的检测技术在生物医学领域得到广泛的应用，癌症的SERS光谱的检测已成为研究的热点。目前有报道对组织和细胞中的生物大分子如DAN、RNA的检测，并获得较好的SERS光谱，但尚未见对人体血液中RNA 的SERS光谱检测的研究报道，如果这一研究应用于实际，将有益于对人结肠癌或其它癌症的检测。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种采用不同SERS光谱增强基底，特别是采用银纳米薄膜基底来检测血液中RNA分子的SERS光谱的检测技术。

为实现本发明的目的采用的技术方案是：

1. 血液中提取RNA分子

从人的全血中分离出血清并放到 -80℃冰箱保存，以防RNA的裂解。使用Trizol LS reagent从血清中提取RNA，用30μl的焦碳酸二乙酯 (DEPC)水溶解RNA，并用微量紫外分光光度计 (NanoDrop ND) 1000定量RNA，浓度为18.8到56.4ng/mL，提取的RNA样品备用。

2.  SERS光谱增强基质银纳米粒子的制备

采用柠檬酸钠还原方法，制备银溶胶增强基质，取10 mg硝酸银溶于50mL去离子水中，加热至100℃使之沸腾，然后将1 ml浓度为1%的柠橄酸三钠逐滴加入，并快速搅拌，滴加完后继续保持沸腾6小时得到银溶胶溶液。银溶胶溶液自然冷却后，用离心机离心分层，将上层清液丢弃，得到银溶胶浓缩液。

3. SERS光谱增强基底银纳米薄膜的制备

取银溶胶浓缩液滴加到矩形铝片上扩散成胶体膜，然后将0.1M的MgSO₄ 溶液滴加到胶体膜上，银溶胶迅速发生聚集，待聚集的银溶胶在室温下自然凉干之后，再用移液枪向其滴加5μl RNA样品；室温下孵育3 min后再进行SERS光谱检测。这种方法与一些文献中报道的胶体与样品直接混合不一样，经MgSO₄溶液聚集的银胶在室温下自然凉干之后，会形成一层银纳米薄膜，与样品结合后会产生很强的电磁增强效应和额外的化学吸附作用，从而得到很强的SERS光谱信号。

4. RNA样品的SERS检测

使用共聚焦显微拉曼光谱仪测量样品的拉曼光谱，测量条件为激发光波长785 nm，激发光功率为50 %，CCD取谱时间10 s，在20 ×物镜下测量样品的拉曼信号，拉曼光谱取谱范围为400-1800cm^-1，对每条光谱的原始数据通过软件进行多项式拟合扣除荧光背景，从而获取SERS光谱。

5. SERS光谱数据的收集与分析

检测不同RNA样品的SERS光谱，并建立表面增强拉曼光谱数据库，采用合适的统计软件对所述表面增强拉曼光谱数据库进行统计分析，建立表面增强拉曼光谱分析模型。