[发明专利]一种检测目标微生物的方法及生物传感器

说明书

技术领域

本发明涉及生物检测试剂，特别是一种检测目标微生物的方法及生物传感器。

背景技术

1990年，两名科学家采用体外筛选与PCR相结合的新技术从人工构建的寡核苷酸文库中分别筛选到了与有机染料和噬菌体DNA聚合酶特异性结合的寡核苷酸序列。这种新技术后来被命名为指数富集配体系统进化技术(systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)，筛选到的寡核苷酸被命名为适配子(aptamer)。

适配子是人工合成的单链寡核苷酸(DNA或RNA)，能够与靶物质进行高特异性与亲和性地结合，其功能类似抗体，但比抗体具有更多的优势，包括如下几个方面：(1)靶分子范围广。可以从金属离子等小分子到蛋白质这样的大分子乃至整个细胞。(2)高特异性与亲和性。适配子能够识别出靶分子结构上如甲基与羟基这样的细微区别，且与靶分子结合后的解离常数处于纳摩尔和皮摩尔水平。(3)体外筛选，易人工合成。可以通过SELEX技术的自动化进行大批量低成本生产，且批间差异较小，同时也能针对毒素及免疫原性较弱的物质进行筛选。(4)稳定性好。对温度及PH不敏感，易于保存与运输。(5)易修饰，便于标记。可以在适配子寡核苷酸的精确位点进行修饰，增强其稳定性，同时能够连接各种标记分子与药物，进行临床诊治。(7)分子小，空间位阻小。可以与靶分子高效绑定，也易实现细胞内药物运送与治疗。如此优良的特性越来越受学者们的青睐。

随着SELEX技术的不断发展，目前科学家已经将整个细胞、病毒及细菌作为靶物质对其进行适配子的筛选，并且取得了较大的进展。2010年，Ohk，S.H.等通过SELEX技术筛选到了单核细胞增生李斯特氏菌的适配子(A8)，这段单链DNA寡核苷酸序列能够高特异性与亲和性地与单核细胞增生李斯特氏菌结合。

胶体金又称金纳米颗粒，是指尺寸在1-100nm的金颗粒，具与宏观物质不同的特性，如比表面积大、量子尺寸效应等。除此之外，金纳米颗粒自身还具有很多特殊的性质：(1)光谱学性质：纳米金属颗粒由于粒子表面导电，电子振荡强度的聚集会形成特征等离子体共振吸收峰(520nm左右)，并随粒子尺寸的变化，吸收峰位置也发生一定程度的红移。如果金纳米颗粒发生聚集，吸收峰会转移至600-700nm范围内。最大吸收峰位置不同，不同尺寸的金颗粒颜色会发生改变，即随着半径的增大、粒子间距离的变化，颜色发生由黄色、红色到蓝色的变化。将此方法用于生物检测中，不但简化了操作步骤，而且还可以获得较高的灵敏度。目前，在生化及医学领域受到了广泛的重视，并产生了很多检测试纸，主要就是应用了纳米金聚集产生颜色变化来判断检测结果。(2)化学性质。金纳米颗粒可以与一些亲和试剂发生吸附，生成一些具有特殊功能的基团。例如，金颗粒可以与氨基发生非共价键的静电吸附；可以与巯基产生强的共价键，不改变金纳米颗粒相似的光谱学性质，为其在生物检测中的应用提供了依据。此外柠檬酸钠处理过的纳米金颗粒在NaCl存在的情况下极为不稳定，很容易发生聚集，这一性质也经常用于生物学的研究，目前常用的纳米金颗粒均经过柠檬酸钠处理。

但是目前没有纳米金与适配子结合起来进行病原微生物检测的报道。

发明内容

本发明根据上述领域的空白，提供一种种检测目标微生物的方法及生物传感器。能够简便、快速、准确地检测是否存在目标，如致病菌、病毒等。

一种检测目标微生物的方法，其特征在于，将待测微生物制成的菌悬液加入到含有目标微生物的适配子和适配子互补链的胶体金颗粒溶液中孵育，所述适配子互补链连接在胶体金颗粒I表面，通过目标微生物与适配子的识别结合使胶体金颗粒的聚散状态发生改变产生的溶液颜色变化来判断检测结果。

所述适配子连接在胶体金颗粒II表面。

所述胶体金颗粒溶液的溶剂为10mM PB，0.3M NaCl，pH 7.4的PBS溶液。

所述菌悬液与所述胶体金颗粒溶液的体积比为：0.5～3∶1

所述胶体金颗粒溶液中适配子的浓度为0.5uM。

所述菌悬液的溶剂为10mM PB，0.3M NaCl，pH7.4的PBS溶液

所述目标微生物为单核细胞增生李斯特氏菌，所述适配子的核苷酸序列如Seq ID No.2所示，所述孵育温度为4摄氏度。

所述菌悬液在加入到胶体金颗粒溶液之前先在4摄氏度孵育2～5分钟。