[发明专利]一种用于免疫细胞治疗的活化单个核细胞的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及制备用作细胞免疫治疗剂的活化单个核细胞的方法，通过从人体外周血液中分离得到单个核细胞，在体外大量培养增殖并活化的单个核细胞，将该活化单个核细胞施予单个核细胞来源的人体；或通过冻存该活化单个核细胞，在需要的时候解冻该冻存的活化单个核细胞并施予单个核细胞来源的人体。达到增强免疫力，治疗癌症、感染性等疾病的作用。

背景技术

机体内具有杀伤作用的淋巴细胞有自然杀伤细胞、杀伤细胞杀伤性T细胞等。它们能识别并清除某些细胞，如癌细胞或感染病毒的细胞。因此，利用那些细胞的功能可以预防和治疗这些疾病。然而根据实验观察，清除一个肿瘤细胞需要上百个淋巴细胞。而一立方厘米大小的瘤块中约有10亿个瘤细胞。因此，过继免疫需用大量的淋巴细胞才能收效。早期过继疗法的淋巴细胞取自经肿瘤免疫的个体。但要从一个患过肿瘤的人身上得到如此大量的淋巴细胞是很不现实的。为此，如果将患者免疫细胞在体外大量增殖和激活，然后再回输该自体患者，有可能获得期望较高的抗癌效果。活化单个核细胞是一种细胞免疫治疗产品，通过在体外大量增殖和激活从人外周血中分离的单个核细胞，并将其回输该自体患者，用于治疗癌症。

二十世纪八十年代以来，开展了大量的免疫疗法临床试验，从Rosenberg等人的研究[Rosenberg et al.，N Engl.J.Med.313，pp.1485-1492，1985]以来，杀伤细胞在肿瘤的过继疗法中被广泛应用。到目前为止，先后出现了五种引人注目的免疫效应细胞：淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK细胞)、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL细胞)(Itoh K，et al.J Exp.Med.168：1419-1441，1988)、抗-CD3抗体和白细胞介素-2(IL-2)诱导的杀伤细胞(AK-T细胞)(Uberti JP，et al-Clin.Immunol.Immunother，70：234-240，1994)、细胞毒T淋巴细胞(CTL)(Aruga A，et al-Int.J.Cancer，49：19-24，1991)和细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK细胞)(Schmidt-wolf IGH，et al.J.Exp.Med.174：139-149，1991)。其中LAK细胞、TIL细胞和CTL细胞因为技术等多方面原因未能广泛应用。

目前现有技术己尝试在不同方面发展了CIK技术。本发明在现有基础上引入替曲托肽提升杀伤细胞活性。替曲托肽是一种人工合成的功能性4分支多肽产物。该短肽具有能迅速特异性地与巨噬细胞、单核细胞的结合，增加其活性和与T淋巴细胞的接触，从而提高巨噬细胞对外来入侵者或自身变异细胞的杀伤作用，提高自然杀伤细胞(NK细胞)的活性，促进T淋巴细胞的细胞毒作用，使机体T淋巴细胞和其它免疫细胞增强识别和杀伤外来入侵病原体或自身变异的细胞(如肿瘤细胞)的能力。因此该短肽在临床上具有重要的抗感染和抗肿瘤的应用价值。

发明内容

本发明主要在于提供制备活化单个核细胞的方法，其中在抗CD-3抗体、IL-2和替曲托肽存在下，通过从人体外周血中分离培养单个核细胞，可以大量制备对肿瘤细胞和感染病毒的细胞具有很强杀伤力的CIK细胞。

本发明的另一个特点在于提供一种细胞免疫治疗组合物，该组合物包含根据所述方法增殖的活化单个核细胞作为活性成分。

本发明的基本步骤如下：

一、外周血单个核细胞(PBMC)的制备：

取人抗凝外周血20～50ml用Hank’s平衡液稀释一倍后，用Histopaque-1077(Sigma-Aldrich)离心分离PBMC。离心条件为：转速2000rpm，25-30分钟。然后用Hank’s平衡液洗涤PBMC 2次，再进行显微镜下细胞计数，用淋巴细胞培养液AIM-V调节细胞密度成3～5×10⁶/ml的细胞悬液。

二、单个核细胞的诱导和扩增：

将上述PBMC悬液置于培养瓶中，并添加IL-2、抗CD-3抗体和替曲托肽，终浓度分别为100-2000u/ml，10-200ng/ml，1-2000ng/ml。置于37℃，5％CO₂饱和湿度培养箱中培养12-16天。每间隔3-4天更换新鲜AIM-V培养基，同时添加IL-2、抗CD-3抗体和替曲托肽。

三、活化单个核细胞的收获：

离心收集增殖并活化后的单个核细胞，离心条件为1000rpm，5-10分钟。用生理盐水重悬该单个核细胞至终浓度0.5-1×10⁷/ml。此产物可用于人体回输。