[发明专利]一种植物根系相关功能基因研究模型的构建方法

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种快速分析与根相关的功能和基因的前处理方法，即植物根系相关功能基因研究模型的构建方法。

(二)背景技术

黄瓜不仅是重要的果蔬两用的蔬菜作物，而且，黄瓜也是研究植物性别分化决定、研究植物维管生物学(包括木质部和韧皮部)、研究植物长距离信号传导等植物生理的模式植物(Huang Sanwen et al.The genome ofthe cucumber，Cucumis sativus L.，Nature Genetics，2009，41(12)：1275-1281)。

另一方面，根系对植物地上部的生长及生物学产量起到重要的作用，根系具有固定、吸收、合成和分泌的功能，与根系分泌行为密切相关的根际研究、化感作用、修复受污染土壤等已经成为日益活跃的研究领域(Kijne JW et al.Root lectins and rhizobia.Plant Physilogy，1997，115(3)：315-320)。

为了研究植物根系相关基因的功能，目前使用的方法有RNA干涉、增强子陷阱、激活标签等分析法，但所有这些方法都需要获得转基因植物才能进行基因功能的验证。虽然目前包括黄瓜在内的多数植物建立了农杆菌介导法、基因枪法、花粉管通道法、电击法、注射法等转基因方法；但是，这些植物转基因方法存在技术效率低(转基因再生植株的频率低)、实验周期(需要花费大量的时间)、劳动强度大(需要大量的实验操作)等问题，因此还不能大规模地应用(章冰，卫志明.《植物遗传转化中存在的问题及对策》.2000，36(3)：245-251。何光源，杨广笑，刘勇.《植物基因工程》，清华大学出版社，2007年4月第1版，第203～204页)。

发根农杆菌侵染植物细胞，其Ri质粒中的T-DNA插入和整合到植物基因组中并表达，诱导植物细胞形成毛状不定根。这种毛状不定根在形态上保持了植物原根系统的特征，在生理上具有原根系统完整的代谢通路；这种毛状不定根起源于单细胞而不存在嵌合体，在遗传上具有高度的稳定性和一致性(Hu ZB，Du M.Hairy root and its application in plantgenetic engineering.J Integr Plant Biol，2006，48(2)：121-127。Guillon S，Tremouillaux-Guiller J，Pati P K，Rideau M，Gantet P.Hairy root research：recent scenario and exciting prospects.Curr Opin Plant Biol，2006，9(3)：341-346)。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种植物根系相关功能基因研究模型的构建方法，采用该方法能够快速分析与根相关的功能和基因。

本发明采用的技术方案是：

一种植物根系相关功能基因研究模型的构建方法，所述方法包括：

(1)将植物根系相关功能基因连接到转基因表达载体pRI101-AN上，得到含有目标基因的重组质粒；

(2)将含有目标基因的重组质粒转入到发根农杆菌K599中，以所得带有重组质粒的发根农杆菌K599侵染黄瓜萌发4天的活体苗的子叶下方0.2～0.5cm处，诱导形成转基因毛状不定根，待毛状不定根生长至长度为5～10cm时，在形成毛状根的部位以下剪掉主根，将形成的毛状不定根埋入土壤，继续生长1～2个月，所获得的生长旺盛的带有转基因不定根的植株，即为所述植物根系功能基因的研究模型，用于快速研究分析与根相关的植物生理和基因的功能。

所述植物根系相关功能基因为常规与植物根功能相关的基因和标志基因，如gfp基因，与根辐射形态相关基因SHORT-ROOT(简称SHR)，与产生根毛相关基因SCHIZORIZA(简称SCZ)，与根基本组织子细胞分裂相关基因SCARCROW(简称SCR)等。

具体的，所述方法如下：

(A)将含植物根系相关功能基因质粒与转基因表达载体pRI101-AN进行酶切后，用T4DNA连接酶连接，转化DH5α感受态细胞，在LB+Km 50mg/L固体培养基上筛选阳性克隆，挑取获得的单克隆，在LB+Km 50mg/L液体培养基上繁殖，提取质粒利用酶切进行鉴定，获得含有目标基因的重组质粒；LB+Km 50mg/L固体培养基是指添加Km 50mg/L的LB固体培养基；LB+Km 50mg/L液体培养基是指添加Km 50mg/L的LB液体培养基，以下表示方法类同；