[发明专利]多基因共表达体系及含二硫键功能性蛋白的生产方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因技术领域和生物化学领域，涉及使真核生物的二硫键蛋白在原核细菌内表达形成正确的二硫键、折叠成正确构象、成为可溶性活性蛋白质。具体说，利用能促进二硫键正确形成的同源巯基氧化酶、二硫键异构酶、肽基-脯氨酰顺反异构酶、伴侣蛋白等基因与二硫键蛋白基因在原核细胞内共同表达，或使这些相关酶蛋白和伴侣蛋白与二硫键蛋白在细胞外相互作用，从而产生可溶性活性二硫键蛋白的方法和相关物质。本发明还涉及包涵体蛋白质的复性技术领域。

背景技术

用大肠杆菌(E.coli.)原核系统重组表达真核生物蛋白质的优点是成本低、产量高，但是它的最大缺点之一是表达的真核生物蛋白很多都是包涵体形式，即无活性的沉淀蛋白形式。要使包涵体蛋白变成活性蛋白，首先需用高浓度盐酸胍或尿素溶解包涵体蛋白，然后用各种方法，例如稀释，使重组蛋白恢复活性(复性)[王颖等：“蛋白质复性技术研究进展”生物工程进展，2002，22(2)：61-64]。如该领域众所周知，蛋白质复性耗时、成本高、复性率低。由于包涵体蛋白复性的机理尚不清楚，不同蛋白质的复性条件又有所不同，特别是含二硫键蛋白质的复性很困难，大规模生产问题很多。

因此，如何提高大肠杆菌细胞表达可溶性异源蛋白一直是人们研究的课题[任增亮等：“大肠杆菌高效表达重组蛋白策略”中国生物工程杂志，2007，27(9)：103-109；卢晟晔等：“大肠杆菌中外源蛋白高效表达的影响因素及策略研究的新进展”中国实验诊断学，2006，10(9)：1100-1103]，其中如何形成正确的二硫键对表达可溶性异源蛋白最为关键。目前提出的解决原核系统表达可溶性蛋白的方法主要有以下几种。①使目的蛋白与可溶性蛋白融合一起表达，例如，与硫氧还蛋白(Trx)(见Novagen公司的pET system manual)或二硫键异构酶(PDI)(US 2009/0305351A1)融合表达。此方法常可使目的蛋白可溶性分泌，但最大缺点是得到的分泌性融合蛋白需要去除其融合伴侣才能得到纯化的目的蛋白。在大规模制备中，此步骤往往成本高，而且目的蛋白切下后常常有一部分多留有1至多个氨基酸，得到的是非均一性目的蛋白；②使目的蛋白与大肠杆菌外膜蛋白(OmpA)融合，表达的蛋白分泌到大肠杆菌的周质间隙中进而获得可溶性蛋白[J.Manosroi等，Appl Environ Microbiol，2001，67(6)：2657-2664]。但此法产量低，难以规模化工业生产；③使目的蛋白与参与蛋白质折叠的伴侣蛋白在细菌细胞内共同表达，或加入小分子化合物，例如L-精氨酸[J.Schaffner等，Appl Environ Microb，2001，67(9)：3994-4000]，包括加入大肠杆菌伴侣素60家族成员(GroEL)、热激蛋白70(Hsp70)或其它参与蛋白质折叠的蛋白[P.Goloubinoff等.Nature，1989，337(6202)：44-47]，但此法促进含二硫键蛋白可溶性表达的效果难以满足实际生产需求。④与真核生物二硫键异构酶PDI蛋白共表达[Ostermeier，M等.J Biol Chem，1996，271(18)：10616-10622]。PDI具有一定的巯基氧化活性，同时又能通过异构作用促进蛋白质正确折叠[G.Kozlov等，Febs Journal，2010，277(19)：3924-3936]，另外PDI还具有类似分子伴侣抑制蛋白质沉聚的功能[H.Cai，等，J Biol Chem，1994，269(40)：24550-24552]；⑤采用硫氧还蛋白还原酶(TrxB)和谷胱甘肽还原酶(gor)缺失大肠杆菌突变株[PH.Bessette等，Proc Natl Acad Sci USA，1999，96(24)：13703-13708]。含二硫键蛋白在原核细胞内容易形成包涵体的主要原因在于原核细胞的细胞质氧化还原势较低，不能有效地促进二硫键形成，在TrxB和gor这两种还原酶缺失的突变株细胞中，细胞质氧化还原势中的氧化势提高，而有利于氧化蛋白质半胱氨酸的巯基形成二硫键。⑥采用过量表达自身质膜半胱氨酸氧化还原酶(DsbA和DsbC)的大肠杆菌菌株[J.Qiu等，Appl Environ Microbiol，1998，64(12)：4891-4896；Y Geng等，Appl Environ Microbiol，2010，76(21)：7226-7230]。DsbA具有催化蛋白质巯基氧化的功能，DsbC具有二硫键异构酶活性，二者的过量表达在一定程度上可促进外源蛋白二硫键的形成。综合分析，使目的蛋白与可溶性蛋白融合一起表达能够较为有效地促进大多数目的蛋白(包括含二硫键蛋白)可溶性表达，但制备成均一性纯化目的蛋白困难；而⑤-⑥方法生产成本较高，据报导④-⑤-⑥三种方法只能使二硫键蛋白一定程度上可溶性表达。