[发明专利]利用环化RNase H检测基因多态性SNP位点的方法

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种分子生物技术领域的方法，具体是一种利用环化RNase H检测基因多态性SNP位点的方法。

背景技术

单核苷酸多态性SNP是指在基因组上单个核苷酸的变异而导致的基因序列的多态性。SNP在基因组中分布相当广泛，近来的研究表明在人类基因组中每300碱基对就出现一次。SNP在高危群体的发现、疾病相关基因的鉴定、药物的设计和测试以及生物学的基础研究方面具有重要的应用价值。目前，已开发了多种SNP的检测技术。但是现有SNP检测技术或是操作过程繁琐[BioTechniques，2009，46：201-208]，或灵敏度差[BMC Genomics 2010，11：641]，或需要昂贵的检测设备[Nucleic Acides Research，2003，Vol.31，No.7e37]，或检测成本过高[BMC Genomics，2006，7：291-291]。

RNase H具有识别DNA与RNA杂合双链中错配碱基的特性。(1)当杂合双链完全匹配时，RNase H能够识别杂合双链中的碱基并切割杂合双链；(2)当杂合双链中含有错配碱基时，RNase H不能识别杂合双链中的碱基，不能切割杂合双链。利用RNase H这一特殊的酶学特性结合PCR技术可以快速、精确地对SNP位点进行检测。但是，线性RNase H的缺点是在PCR较高的反应温度下往往变得不稳定甚至失活。而蛋白质环化后在生物学活性未受影响的同时其热稳定性得到提高的报道[Rev.Biochem.2003，72，249-289]为提高RNase H的稳定性提供了重要依据。

转肽酶Sortase A具有环化蛋白质的功能。在线性蛋白质在N端含有寡聚甘氨酸、C端含有转肽酶Sortase A的识别序列LPXTG时，在转肽酶Sortase A的作用下会将线性的蛋白质环化[JBC，2009，M901752200]。

发明内容

本发明针对现有技术存在的上述不足，提供一种利用环化RNase H检测基因多态性SNP位点的方法，利用转肽酶Sortase A将线性的RNase H环化、具有茎环结构的探针、待测DNA片段、待测DNA特异性的正向引物与反向引物、Vent DNA聚合酶、环化的APE RNase HII，测定待测DNA片段特定位点的SNP，提高了RNase H的热稳定性。

本发明是通过以下技术方案实现的，本发明包括以下步骤：

步骤一、纯化N端含有寡聚甘氨酸、C端含有转肽酶SortaseA识别序列的线性APE RNase HII，具体步骤包括：

1.1)设计特异引物对表达载体pTWIN的多克隆位点进行突变，将酶切位点Not I前的氨基酸序列突变为寡聚甘氨酸；

突变正向引物：ACTTTGTCGCGAATGACATCATTGTACACAACGGAGGAGGAGG

AGGCGGCCGCAAA

突变反向引物：CAGGAAGAGCCCTCGAGGAATTCGCGGCGGCCTCCTCCTCCTC

CGTTGTGTAC

1.2)设计特异引物通过PCR扩增在待环化蛋白质的C端引入转肽酶Sortase A的识别序列LPXTG；

正向引物：GGGGGGAATTCTTGGGCATAGTCGTCGGCGTG

反向引物：GGGGGGGATCCCTATCCGGTTTCTGGTAAACCTCCCAGGAA CTC

GTCC

1.3)选取突变载体pTWIN中双酶切位点Not I/Bam H I，构建含有Sortase A识别序列的蛋白质亚克隆；

1.4)利用表达的线性融合蛋白质N端含有的CBD标签，通过几丁质纯化柱，非变性纯化N端含有寡聚甘氨酸、C端含有识别序列LPXTG的线性蛋白质，贮存于标准贮存缓冲液中；

所述的标准贮存缓冲液含有20mM Tris-HCl以及150mM NaCl且pH 8.0。

步骤二、环化N端含有寡聚甘氨酸、C端含有识别序列的线性APE RNase HII：转肽酶Sortase A与线性的APE RNase HII在标准反应缓冲液并温浴24h。

所述的标准反应缓冲液含有20mM Tris-HCl以及150mM NaCl和10mM CaCl₂且pH 8.0。

所述的转肽酶SortaseA与线性的APE RNase HII的浓度比为1∶1的比例。

所述的温浴为37℃。