[发明专利]过表达CodY蛋白的苏云金芽胞杆菌基因工程菌YBT-881-L1的筛选及鉴定

说明书

技术领域

本发明属于农业微生物基因工程技术领域，具体涉及一种过表达CodY蛋白的苏云金芽胞杆菌基因工程菌YBT-881-L1的筛选及鉴定。本发明涉及微生物农药基因工程菌的选育与应用。

背景技术

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)是一种天然存在的昆虫病原细菌，对无脊椎动物中的4个门和节肢动物门中16个目的3000多种害虫有活性。随着研究的深入，cry1基因在杀虫工程菌和转基因抗虫植物中已得到广泛的应用。但是，在实验室条件下已经发现了多种昆虫对Bt亚种或单个毒素可以产生抗性，在小菜蛾的田间种群中也已经出现了具有抗性的个体。因此，筛选和克隆新的毒力高、杀虫谱广、不易产生抗性和交互抗性的cry基因和基因组合是解决这些潜在危机的有效途径之一。

cry2基因在Bt中分布较广泛，而不同的Cry2类蛋白有着不同的杀虫谱和毒力。其中，Cry2Aa对鳞翅目、双翅目害虫及直翅目的黄胫小车蝗具有杀虫活性；cry2A为沉默基因，但在国内外都已实现了有效表达，并发现Cry2Ab对棉铃虫初孵幼虫具有高毒力，能明显抑制二化螟二龄幼虫生长；cry2Ac和cry2Ad在苏云金芽胞杆菌中不常见。研究表明，Cry2A类蛋白与Cry1A蛋白具有不同的结合位点，害虫对这两种蛋白不容易产生交互抗性。Cry2类蛋白与其它杀虫蛋白之间还具有增效作用。第二代抗虫棉中已出现了转cry2Ab基因或同时转cry2Ab和cry1Ac基因的棉花，并且已经在Monsanto公司开始商业化生产。中国也得到了对水稻主要鳞翅目害虫具有抗性的转人工改造的cry2A基因水稻。因此，对cry2基因的研究具有重要的理论和应用价值。

生物杀虫剂优于传统农药的最大原因是由于其杀虫能力没有降低，但与传统农药相比有环保和无残留的优点，因此近年来生物杀虫剂得到了全世界范围的关注。目前苏云金芽胞杆菌是全世界使用最广泛、最成功的生物杀虫剂，这个过程经历了近110年的历程。1915年正式将这种有杀虫能力、革兰氏阳性、生存在土壤中的微生物命名为苏云金芽胞杆菌，从发现到得到正式命名经历了15年(喻子牛，1990)。苏云金芽胞杆菌之所以具有杀虫能力是由于在形成芽胞的同时形成了伴胞晶体，即杀虫晶体蛋白(Insecticidal crystal proteins，ICPs)，这种晶体的杀虫能力是特异性的。

苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白在稳定期大量表达并且以伴胞晶体的形式在母细胞中积累，其表达量可达到整个细胞干重的20-40％。也就是说，每个细胞大约需要合成1-2×10⁶个ICPs分子才能组装成这样的晶体(Schnepf and Crickmore，1998；Errington，1993)。因此，苏云金芽胞杆菌内一定存在调节机制来调节cry基因的表达。近来一系列的研究表明，苏云金芽胞杆菌cry基因的高效表达调控机制主要涉及转录水平、转录后水平、翻译水平和翻译后水平等多个层次的正向调节，才最终使得cry基因能够高效表达并形成伴胞晶体。不同的cry基因调控机制也各不相同，即便是同一基因在不同宿主细胞中表达也不相同，说明原毒素的合成存在着错综复杂的调控机制。深入认识这些调控机制，构建高效广谱工程菌具有重要的理论意义和实践意义。

全局性转录调控因子CodY广泛存在于G+C含量较低的革兰氏阳性细菌中，它是调节稳定期早期基因和芽胞形成基因转录的全局调控因子，它调控很多基因，包含将近200个基因。这些基因包括一些可产生与大分子降解、营养物质运输、生物代谢、抗生素合成、趋药性等有关的物质。这些基因大都是在快速生长期被阻遏，而营养缺乏时被诱导表达，帮助细胞适应营养匮乏时期。