[发明专利]一种泥鳅温和气单胞菌疫苗的制备与使用方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种动物抗病疫苗的制备方法，特别是涉及一种泥鳅温和气单胞菌疫苗的制备方法。本发明还涉及该疫苗的使用方法。

背景技术

温和气单胞菌广泛存在于水环境中，世界各地均有分布，属条件致病菌，可引起鱼类及其他水产养殖动物的多种疾病，给水产养殖业造成了严重的经济损失。因此，对病原温和气单胞菌的高效预防，以最大限度地降低其危害程度，将能显著地提高泥鳅养殖生产的经济效益。在养殖鱼类细菌性疾病防控方面，目前在养殖生产中大多使用化学合成药物或抗生素类药物控制疾病的发生与流行，但在长期的药物使用中，人们认识到药物治疗存在很多不足：一是病因复杂，大量用药存在盲目性，很多疾病尚无针对性的有效药物；二是一些化学药物有效面窄，预防作用弱，而且病鱼往往因厌食难以摄取到有效的药物剂量；三是药物在动物体中残留，危害到人类的健康，且长期用药带来环境污染，并导致耐药性微生物大量出现；此外，长期在药物“保护作用”下使大量本应被淘汰的抗病力弱的个体存活下来且在种群中所占比例逐渐增大而导致整个群体的抗病能力下降，严重影响了养殖业的发展。因此，应用免疫学技术预防鱼类细菌性疾病的发生已受到越来越多的重视，已成为各国研究者关注的重要内容。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种提高泥鳅免疫力、降低泥鳅养殖生产中由病原温和气单胞菌所造成的危害、以满足泥鳅养殖生产上的抗病需求的泥鳅温和气单胞菌疫苗的制备方法。

本发明所要解决的另一个技术是提供了几种如上所述的泥鳅温和气单胞菌疫苗的免疫使用方法。

本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明是一种泥鳅温和气单胞菌疫苗的制备方法，其特点是：它以泥鳅病原温和气单胞菌LD081008A-1（A.sobria LD081008A-1）为免疫原，以黄芪浸出液为佐剂；其步体步骤如下：

（1）将温和气单胞菌LD081008A-1（A.sobria LD081008A-1）菌株接种在普通营养琼脂肉汤培养基上，28℃培养24h，加入终浓度0.3%的甲醛28℃灭活48h，得灭活菌体；

（2）取黄芪用蒸馏水浸泡30-60min后煎煮，过滤，浓缩至终浓度为原药1g/mL，得黄芪浸出液；

（3）将灭活菌体与得黄芪浸出液混合，制得水剂型黄芪佐剂泥鳅温和气单胞菌疫苗；疫苗中病原温和气单胞菌免疫原为2.7×10⁸cells/mL，黄芪浸出液为1g/mL。

本发明方法中涉及的温和气单胞菌LD081008A-1（A.sobria LD081008A-1）已经在《泥鳅溃疡病及病原温和气单胞菌生物学及分子特征研究》中公开，该公开文献的发表刊物为：《水产科学》，2010，29（12）：696-702。该菌株的分离菌DNA序列长度及登录号如下表：

分离菌DNA序列长度及登录号

以上所述的制备方法所制得的泥鳅温和气单胞菌疫苗的免疫使用方法是：

1、它可以采用浸泡免疫的方法，先将受免鱼在充气条件下用质量浓度为8% 的NaCl溶液浸泡5min，然后按体积比1：5用水稀释泥鳅温和气单胞菌疫苗得泥鳅温和气单胞菌疫苗溶液，再将受免泥鳅放于泥鳅温和气单胞菌疫苗溶液中充气浸泡1h，一周后按前述方法加强免疫1次。

2、它可以采用注射免疫的方法，取体长为10-15cm的泥鳅按0.1mL/尾的免疫剂量进行初次注射免疫，后每隔一周按前述免疫剂量加强免疫1次，共免疫4次。

3、它可以采用口服免疫方法，将硬颗粒饲料用泥鳅温和气单胞菌疫苗浸泡后投喂，每天鱼体摄入灭活菌体量为2.7×10⁶cells/g体重，连续投喂一周，隔周后再按前述方法进行加强免疫一周。

发明人于2010年度3月~6月在江苏省淮海工学院水产动物病害实验室用本发明方法制备的疫苗及免疫方法进行泥鳅免疫保护实验，免疫期结束后，三种免疫方法分别用浓度为3×10⁸CFU/mL的温和气单胞菌LD081008A-1（A.sobria LD081008A-1）注射感染受免鱼。实验结果为使用本发明的温和气单胞菌疫苗经浸泡、口服及注射三种方式免疫泥鳅，均能产生一定的免疫保护力，以注射方式免疫效果最好，浸泡、口服及注射三种方式的免疫保护率分别为46.6%、53.3%、83.3%。详见下表：

免疫鱼经活菌攻毒后的免疫保护力表