[发明专利]晶胞粘连控制基因簇的克隆及在防止晶体降解中的应用

说明书

技术领域

本发明属农业微生物基因工程技术领域。具体涉及晶胞粘连表型控制基因簇的分离、克隆以及它编码的产物在防止晶体蛋白降解中的应用，本发明还与微生物农药技术领域相关。

背景技术

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)是一种广泛存在于各种生态环境中的革兰氏阳性杆状细菌。该物种最大的特点就是在其生长周期中能形成内生芽胞的休眠体，并且在其芽胞形成的同时能产生对许多昆虫具有特异毒性的由杀虫晶体蛋白(Insecticidal Crystal Proteins，ICPs)组成的伴胞晶体。这些杀虫晶体蛋白对鳞翅目、双翅目、鞘翅目、膜翅目、同翅目等昆虫纲10个目500多种昆虫以及原生动物、线形动物门、扁形动物门中某些有害种类也有特异的生物活性(Schnepf H E，Crickmore N，Rie J V，Lereclus D，Baum J，Feitelson J，Zeigler D R，Dean D H.1998.Bacillus thuringiensis and its pesticidal crystal proteins.Microbiol Mol Biol Rev，62：775-806)。由于苏云金芽胞杆菌对多种昆虫都有很高的杀虫活性，而且具有对环境和人蓄无损害等优点，因此被广泛地应用于生物农药的开发。目前，基于苏云金芽胞杆菌开发的生物杀虫剂已经成为最成功的一种生物农药，占到了整个生物农药行业90％以上的市场，广泛地应用于农业、林业和仓储等害虫的防治。

B.thuringiensis的伴胞晶体是在芽胞形成期(sporulation)合成并累积而成。芽胞的形成可分为7个时期，一般在芽胞形成的第二期晶体蛋白开始表达，随着芽胞的进一步发育，晶体蛋白逐渐累积，并形成具有晶格结构的伴胞晶体。当芽胞成熟以后，母细胞自溶，释放出芽胞和伴胞晶体。在绝大多数B.thuringiensis中，伴胞晶体是在母细胞中形成的，在空间上与芽胞无关。一旦芽胞成熟并且细胞自溶后，芽胞和伴胞晶体都释放出来，彼此相互独立。在少数B.thuringiensis的亚种中，芽胞成熟母细胞自溶后，伴胞晶体和芽胞彼此不分离，光学显微镜镜下观察两者是粘连在一起的(简称晶胞粘连)，例如幕虫亚种(Ji F，Zhu Y，Ju S，Zhang R，Yu Z，Sun M.2009.Promoters of crystal protein genes do not control crystal formation inside exosporium of Bacillus thuringiensis ssp.finitimus strain YBT-020.FEMS Microbiol Lett，300(1)：11-17)。

蜡状芽胞杆菌群(包括蜡状芽胞杆菌(B.cereus，简称Bc)、炭疽芽胞杆菌(B.anthracis，简称Ba)和苏云金芽胞杆菌(B.thuringiensis，简称Bt))与B.subtilis相比，其芽胞结构有一个明显的差异，前者在芽胞衣(coat)外还有一层芽胞外壁(exosporium)(Henriques A O，Moran C P Jr 2007.Structure，assembly，and function of the spore surface layers.Annu Rev Microbiol，61：555-588)。大多数B.thuringiensis的伴胞晶体是在芽胞外壁外侧形成的，而幕虫亚种的伴胞晶体则在芽胞外壁和芽胞衣之间形成，从而导致晶胞粘连表型的产生。

目前，苏云金芽胞杆菌应用主要包括两个途径，一种是将苏云金芽胞杆菌的杀虫晶体蛋白基因转入植物中，构建转基因植物，用于农业害虫的防治(Pigott CR and Ellar DJ.2007.Role of receptors in Bacillus thuringiensis crystal toxin activity.Microbiol Mol Biol Rev 71：255-281)；另一种是做成可以在环境中释放的生物杀虫剂。在户外使用过程中，由于晶体蛋白本身对紫外线敏感，在环境中容易被降解掉从而降低杀虫的活性。让杀虫晶体蛋白定位于芽胞外壁的内侧，制成生物囊杀虫剂，是一种具有潜力的防止晶体过快降解的方法；当母细胞裂解后形成晶胞粘连，在环境中释放时由于受到芽胞外壁的保护，可以延长作用时间。对于晶胞粘连机制的研究为这种设想可以提供理论基础。