[发明专利]一种水生鸢尾体细胞再生的组培方法

说明书

技术领域

本发明涉及植物组织培养技术领域，尤其涉及一种利用水生鸢尾体细胞胚进行再生的组培方法。

背景技术

水生鸢尾系鸢尾科鸢尾属的多年生水生植物，原产美国路易斯安娜州。此类鸢尾在北美和欧洲一些国家早已被广泛应用，其花色丰富，花期长达4～5个月，不仅具有花大、色艳、叶花并观等优良观赏性状，而且还有较强的适应性，表现抗寒、耐旱、耐粗放，同时还能在我国长江以南周年保持常绿。目前该系列花卉植物的市场形势看好，但由于其主要以分株、种子进行繁殖，繁殖速度较慢，且费工费时，因此优质苗木供不应求，满足不了市场的需求。

以往水生鸢尾组培快繁都是通过器官发生途径，由外植体分化不定芽后再生植株，故存在外植体诱导愈伤组织周期较长，如从外植体消毒到获得愈伤组织至少需要一个半月，其他各阶段的培养时间也均在一个月左右，导致获得无菌苗速度较慢、繁殖系数不够高、且无菌苗长期连续增殖极易发生退化和变异等缺点。体细胞胚发生是由植物体细胞在离体条件下通过与合子胚类似的发育途径形成新个体的过程，相对于器官发生而言，体细胞胚发生具有数量多、速度快、结构完整、再生率高、后代遗传稳定性高等优点。

浙江省农业科学院从美国引进水生鸢尾新品种后，拟通过体细胞胚再生途径的组培技术大量繁殖无菌苗，以满足国内市场的需要。目前关于水生鸢尾组织培养方面的研究(贾明良，2010；刘慧春，2009；吴月燕，2009；王鹏，2009；杨俊梅，2009；张翼飞，2009；黄洁，2008；朱旭东，2007，2009；徐立军，2005；张金政，2004；黄苏珍，1999，2003；陈德芬，1997)，均是通过器官发生途径再生植株。而通过体细胞胚途径再生植株的研究在槐树(Plata，1990)、香雪兰(王丽，1991；1998)、福禄考(井忠平，1992)、仙客来(李会宁，2001；曲复宁，2003)、长寿花(马国华，2003；王桂兰，2003)、兰考泡桐(Ipekci，2003)、黄枝阔叶椴(Chalupa，2003)、黑种草(Elhag，2004)、月季(瞿素萍，2006)、地被菊(蒋细旺，2008)、多花蔷薇(田传卫，2008)等观赏植物上已有报道。但关于水生鸢尾体细胞胚再生途径的组培技术研究，在国内外均未见报道。

发明内容

本发明目的是，针对水生鸢尾常规组织快繁技术中所存在的外植体诱导愈伤组织周期长、获得无菌苗速度慢、繁殖系数低、无菌苗长期连续增殖极易发生退化和变异等缺陷，提供一种能大量快速繁殖结构完整、再生率高、无菌种苗后代遗传稳定的水生鸢尾组织培养的方法。

本发明目的通过以下技术方案来实现。

一种水生鸢尾体细胞再生的组培方法，该方法按如下步骤进行：

(1)培养基的配制，包括基本培养基和组培各阶段培养基的组分与各组分每升所含重量为：

1)基本培养基：水生鸢尾芽诱导采用MS培养基，叶片胚状体诱导和增殖、壮苗及生根均采用WPM培养基；其中，白糖15～60g/L，琼脂5～8g/L，pH5.6～5.8；

2)芽诱导培养基：MS+6-BA0.5～1.0mg/L和NAA0.2～0.5mg/L；

3)叶片胚状体诱导培养基：WPM+ZT 0.0～1.0mg/L、TDZ 0.25～0.3mg/L和2，4-D 0.0～0.1mg/L；

4)继代增殖培养基：WPM+ZT 0.5～1.0mg/L、TDZ 0.25～0.3mg/L和2，4-D0.05～0.1mg/L；

5)壮苗培养基：WPM+BA0.3～1.0mg/L和NAA0.1～0.3mg/L；

6)生根培养基：WPM+IBA0.5～1.5mg/L+NAA0.5～1.5mg/L；

(2)水生鸢尾脱毒组培苗的培养：

1)外植体的采取与灭菌：取健壮水生鸢尾植株剪除基部以上叶片及根系后的幼嫩芽，经10％洗洁精浸泡8～10min、流水冲洗3～4h后，于超净工作台上用无菌水冲洗干净；用70％酒精浸泡30～60s，再用0.1％升汞水溶液浸泡8～10min进行灭菌后用无菌水冲洗5～6次；将其茎尖组织块拨出、切成0.2～0.5cm³小块作为外植体，备用；

2)芽诱导培养：将上述茎尖外植体接种到步骤(1)2)芽诱导培养基上，在温度25±2℃，光强1500～2500Lx，光照时间12h/d条件下进行芽诱导培养10～20天至诱导形成丛生芽；