[发明专利]一种烟叶生化添加剂及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于烟用添加剂的技术领域，更具体地说，本发明涉及一种生化添加剂。同时，本发明还涉及所述添加剂的制备方法和在烟草工业中的应用。

背景技术

烟草是一种以吸食为目的的特殊经济作物，其使用价值取决于它的品质。香吃味是评价烟叶品质的重要指标，优质烟叶要求烟香气质纯正，香气量充足，吃味醇和，余味舒适。烟叶从种植到卷制成卷烟产品是一个复杂的系统工程，期间需要经历打叶复烤、烟叶醇化等一系列步骤。其中，打叶复烤是解决收获烟叶品质上存在缺陷的基本方法，即将烟站收购的初烤把装烟（亦称原烟）运到复烤车间进行第二次烤制，将整片烟打制成一定规格的碎片烟，在打叶复烤过程中杀虫，促进青烟转黄，减轻刺激和杂气，并控制烟叶水分在11％～13％范围内，防止烟叶在仓储过程中生虫霉变。现有技术中打叶复烤后的碎片叶经过机械打包后，需要堆放在烟叶醇化仓库内，在自然条件下贮存2～3年，通过自然醇化改善烟叶的抽吸品质。这种自然醇化方法由于烟叶过于干燥，会抑制附着于烟叶表面的有益微生物的生长，所需烟叶醇化时间过长，增加了仓储成本。

虽然可以通过添加外源生物酶以缩短醇化时间，但由于外源生物酶的品种过于单一，造成香性物质的种类减少，香气自然感、层次感有所减弱。同时，这种添加外源生物酶自然醇化的生产方式，人工和酶制剂的成本较高，这些都使得现有生产方法周期过长，需要占用大量资金和库房，生产成本较高。如何克服上述问题，现有技术中尚无理想的解决办法。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种新的生化添加剂。

本发明的另一目的是提供所述生化添加剂的制备方法。

本发明进一步的目的是提供所述生化添加剂在烟叶醇化中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案予以实现。

* 除非另有说明，本发明中所采用的百分数均为质量百分数。

A. 本发明提供了一种生化添加剂，该添加剂是通过对短小芽孢杆菌 (Bacillus pumilus) Van35的发酵产物提取。

本发明从烤烟叶面上分离到一株细菌Van35，鉴定结果表明该细菌属于短小芽孢杆菌，该菌株命名为 (Bacillus pumilus) Van35。该菌株已经保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCG）；该中心地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期：2009年11月5日；保藏号为CGMCC No. 3411。

短小芽孢杆菌Van35菌株的形态学和生理生化性质特征为：菌体呈杆状，革兰氏阳性，芽孢椭圆形中生或端生，不膨大，芽孢比菌体小存在于菌体中。菌落呈圆形，扁平无凸起，乳白色，有光泽，边缘不整齐。常规生理生化实验表明：ND12是好氧菌，过氧化氢酶实验，VP 实验，产H2S实验，明胶液化实验和卵磷脂酶实验曾阳性；水解淀粉实验，产NH3 实验，甲基红实验，吲哚实验，水解脂肪实验和硝酸盐还原实验呈阴性。

短小芽孢杆菌Van35的分子鉴定特征为：利用通用引物20F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和1500R（5’-GGTTACCTTGTTACGA CT-3’），以短小芽孢杆菌Van35的基因组DNA作为模板扩增得到1500 bp左右的PCR产物，回收测序、校正之后得到的Van35菌株的部分16S rRNA基因序列1510 bp, 该序列已经递交国际核苷酸序列数据库（GenBank），序列索引号为：GU290547。

B.本发明提供了一种烟叶生化添加剂的制备方法，该方法采用下述步骤：

（1）将短小芽孢杆菌（B. pumilus）Van35扩大发酵培养；

将 50 mL液体种子培养基分装于250 mL三角瓶中，接种菌株Van35，于 30oC振荡 (180 r/min)培养 24 h，得到液体种子。接种8%的液体种子于装有240 mL液体种子培养基的1000 mL三角瓶中，于30oC振荡 (180 r/min)培养24 h，得到用于扩大培养的液体种子。

（2）通过过滤或离心收集发酵液；

然后，无菌操作将 8%的液体种子接种到装有60 L液态产酶培养基的100 L发酵罐中，于30oC静态培养36小时放罐。离心（8000 rpm, 20 min）收集发酵液。

（3）通过硫酸铵沉淀发酵液中的蛋白质，离心收集沉淀；

按照发酵液体积加入硫酸铵（56%，w/v），搅拌2 h，再次离心（8000 rpm, 20 min）收集沉淀