[发明专利]一种混合营养无菌培养微藻快速积累油脂的方法

说明书

技术领域

本发明涉及藻类生物培养技术，尤其涉及一种混合营养培养小球藻快速生长并大量积累生物油脂的方法。

背景技术

近年来，全球能源需求不断扩大，寻求可以替代石油的可再生清洁能源是目前急需解决的重要问题。藻类具有光合作用效率高、环境适应能力强、生长周期短、生物产量高、油脂含量丰富的特点，因此藻类是制备生物油燃料的良好材料。但目前生产微藻生物燃料的主要问题是培养成本较高。只有首先解决快速生长和高油脂含量微藻品种的选育，优化培养条件和工艺，改良大规模生产条件，提高目标产物脂质的高效分离才能有效降低生产成本。

普通小球藻(Chlorella vulgaris)是一种可利用有机碳源异养培养的绿藻，生长速度比光照条件下快，类似于细菌的代谢生长，通过异养转化可获得高脂肪含量的异养小球藻。迄今为止大规模培养小球藻主要采用开放池式户外培养系统以及各种半密闭和密闭培养系统，由于仍然采用光照自养方式，成本高，生产效率偏低。以有机物作为小球藻的唯一碳源进行异养培养，具有无需光照，细胞增殖快，浓度高，生产系统易于实现自动控制，可利用现有的发酵设备等优点。但藻细胞异养生长的培养液极易染菌，目前发酵设备的通气经过滤膜简单过滤装置除菌，无法彻底除去空气中的其他杂菌，且滤膜需要定期更换，成本较高。

发明内容

本发明提供一种混合营养无菌培养高密度小球藻的方法和油脂提取方法，其制备过程为：

a.采用小球藻自养通气培养获得较高生物量：在50mL改良SE液体培养基中培养小球藻细胞，再逐步移至250mL，500mL，3000mL的三角瓶中无菌通气扩大培养，温度25～27℃，培养时间4-5天。

其中，所述改良SE液体培养基成分为：每1000mL培养基中含有NaNO₃ 0.25g，CaCl₂.2H₂O 0.025g，MgSO₄·7H₂O 0.075g，K₂HPO₄ 0.075g，KH₂PO₄ 0.175g，NaCl 0.025g，FeCl₃·6H₂O 0.005g，Fe-EDTA 2mL，A5微量元素混合液1mL。

其中，所述无菌通气扩大培养方法为：用磁力空气压缩泵通入1％的硫酸铜溶液除菌，再经无菌水除去空气中的微量硫酸铜成分，最后无菌空气通入3000mL三角瓶提供细胞所需CO₂及悬浮和搅拌。

其中，所述通气培养为：磁力空气压缩泵通气流量10-15L/min，培养温度22～27℃，光照120μmol·m^-2·s^-1。

b.采用添加有机物的通气异养培养小球藻快速获得油脂积累：添加有机物为浓度40g/L的无菌葡萄糖溶液，并进行遮光通气培养，培养温度22～27℃。

其中，所述无菌葡萄糖溶液经80℃蒸汽压力灭菌，灭菌时间20分钟。

其中，所述遮光通气培养的通气流量为20-25L/min。

c.小球藻干藻粉采用碱催化的无水乙醚-石油醚方法提取油脂：取适量小球藻藻粉于5mL离心管中，充分研磨后加入3mL无水乙醚-石油醚混合液，40℃条件下适当振荡浸提，加入10％的氢氧化钾溶液静止30min，将混合溶液4000rpm离心10min收集上清液于已恒重的离心管中，60℃水浴蒸去多余的溶剂，称量并计算油脂含量。

其中，所述无水乙醚-石油醚混合液的体积比为1∶2。

本发明提供的方法与现有技术方法相比的积极效果如下：

(1).所述混合营养无菌通气培养小球藻方法，能有效除去通气时带入的病菌和其他微生物。通气不仅提供细胞悬浮搅拌的作用，而且在培养过程中提供有效碳源，使小球藻在无机培养基中快速大量繁殖，此时小球藻迅速形成生长优势，也不利于杂菌生长。

(2).所述第二阶段添加少量葡萄糖进行小球藻异养暗培养，能迅速提高微藻油脂积累，藻细胞中油脂含量大大增加。通过混合营养无菌培养小球藻，每升藻液可得小球藻粉约为3.77g。完全自养条件下培养得到的小球藻，每升藻液所得藻粉仅为0.123g。

(3).所述混合营养无菌通气培养小球藻方法，培养液中藻细胞浓稠、颜色变黄，藻细胞叶绿素消失，细胞体积增大，藻细胞中油脂含量大大增加，是自养条件下油脂含量的4.8倍。完全自养条件下培养得到的小球藻颜色深绿，细胞数量相对较多但油脂含量低。