[发明专利]炭疽芽孢杆菌检测试剂盒及其使用方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物检测试剂，具体涉及一种炭疽芽孢杆菌检测试剂盒及其使用方法。

背景技术

炭疽芽孢杆菌属于需氧芽胞杆菌属，能引起羊、牛、马等动物及人类的炭疽病，并能造成环境的广泛污染。由于炭疽芽孢具有对外界环境极强的抵抗力，造成这种污染常持续存在。因此准确、快速地检测炭疽芽孢杆菌具有十分重要的意义。

传统炭疽芽孢杆菌检测方法，由于其检测周期长、程序复杂、所需试剂繁多等缺点已远远不能满足现代检测要求。以聚合酶链式反应（PCR）技术为代表的病原核酸检测技术在实际应用中存在一些问题，如普通聚合酶链式反应（PCR）技术需要专门的仪器，而且存在容易交叉污染和操作过程烦琐的缺点。而荧光实时定量聚合酶链式反应（real time PCR）技术虽然较好地解决了交叉污染的问题，并简化了操作过程，但却需要更复杂的定量测定仪器，因此不适用于现场快速检测。而且实时定量聚合酶链式反应PCR技术中荧光探针的成本较高，加大了推广应用的难度。免疫学检测技术快速简便成本低廉，但要求高质量高稳定性的单克隆抗体，否则因准确性不够，目前只能是辅助检测手段。所以及时运用生物技术发展的最新成果对满足病原微生物检测要求的不断提高具有重要意义。其中恒温扩增（Isothermal Amplification）核酸快速检测技术是病原核酸检测技术上的长足进步，现已建立起来的环介导恒温扩增技术（LAMP）具有很多的优越性。

因此，需要一种检测效果更全面、特异性高、漏检率低的炭疽芽孢杆菌检测试剂盒及其使用方法以解决上述问题。

发明内容

本发明的目的在于解决现有技术的不足之处而提供一种检测效果更全面、特异性高、漏检率低的炭疽芽孢杆菌检测试剂盒。

本发明的目的可以通过以下技术措施实现：一种炭疽芽孢杆菌检测试剂盒，所述的炭疽芽孢杆菌检测试剂盒包括以炭疽芽孢杆菌的PA基因为靶基因、基于环介导恒温扩增技术设计的两对引物：内引物FIP/BIP和外引物 F3/B3。

本发明检测的是PA基因。该PA基因是炭疽芽孢杆菌保护性抗原基因。

与NCBI网站nt数据库的BLAST比对结果显示，除炭疽芽孢杆菌外，无其它菌带有该基因。

作为本发明炭疽芽孢杆菌检测试剂盒的优选实施方式，所述的两对引物为

外引物F3：（SEQ ID NO 1）

CTGATAGTCAAACGAGAACAA

外引物B3：（SEQ ID NO 2）

AGTTCTTTCCCCTGCTAGA

内引物FIP：（SEQ ID NO 3）

CGCATGCACTTCTGCATTTCTTTTAATACTTCTACAAGTAGGACACAT

内引物BIP：（SEQ ID NO 4）

TCGTTCTTTGATATTGGTGGGAGTTTTTGATAGTGAATGATCAATTGCGAC。

作为本发明炭疽芽孢杆菌检测试剂盒的优选实施方式，所述的炭疽芽孢杆菌检测试剂盒还包括BstDNA聚合酶、反应液、稳定液、样品预处理液、显色液和阳性对照液。

作为本发明炭疽芽孢杆菌检测试剂盒的更优选实施方式，

所述的Bst DNA聚合酶：酶浓度4-10 U/μL；

所述的反应液含：1.6～2mmol/L dNTP、20～25mmol/L Tris-HCl、10～12.5mmol/L KCl、10～12.5mmol/L （NH₄）₂SO₄、8～10mmol/L MgSO₄、0.1～0.125体积％TritonX-100、0.8～1mol/L甜菜碱；

所述的样品预处理液含：10～20 mmol/L pH 8.0的Tris- HCl、1～2 mmol/L EDTA和1～1.2体积% Triton X-100；

所述的显色液为SYBR Green I或Eva Green；

所述稳定液为石蜡油；

所述的阳性对照为炭疽芽孢杆菌基因组DNA；

所述的内引物FIP/BIP各为0.2～0.25μmol/L，外引物F3/B3的浓度各为 1.2～2.0μmol/L。

作为本发明炭疽芽孢杆菌检测试剂盒的最优选实施方式，

所述的Bst DNA聚合酶：酶浓度8 U/μL；