[发明专利]一种4-1BBL蛋白的制备方法

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种4-1BBL蛋白的制备方法。

(二)背景技术

4-1BB/4-1BBL是CD28/B7之外的另一对重要的协同刺激信号分子。4-1BB(CD137)属肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族，主要分布在活化的T细胞、NK细胞和DC细胞等表面，其配体4-1BBL(CD137L)主要表达在专职APC细胞(如单核巨噬细胞、DC细胞、B细胞)、活化的T细胞及一些肿瘤细胞上。4-1BBL是II型跨膜糖蛋白，分子量为34KD，人和小鼠有36％的同源性。

4-1BB/4-1BBL信号对增强和维持免疫应答有重要作用。与CD28/B7信号传导通路比较，4-1BB/4-1BBL主要在免疫应答的后期，为CD8⁺T细胞克隆扩增、存活和记忆性杀伤提供信号，其刺激T细胞增殖和分泌细胞因子的作用在缺乏强大的CD28/B7信号时表现更明显。4-1BB的激活对CD4⁺和CD8⁺T细胞均有作用，但优先刺激CD8⁺T细胞的活化。除了通过4-1BB受体刺激T细胞外，4-1BBL也通过其反向信号传导通路刺激单核细胞，导致M-CSF表达及释放多种细胞因子，延长单核细胞存活期，促进细胞增殖和有丝分裂。

近年，4-1BB/4-1BBL信号传导通路已成为肿瘤免疫治疗设计的一个新靶点。体内实验表明，4-1BB单抗能预防活化诱导的细胞死亡(AICD)，促进荷瘤宿主中淋巴细胞的增殖，并选择性促进I型细胞因子分泌，增强效应细胞的抗肿瘤作用。这种抗肿瘤作用对肿瘤的再次攻击有记忆性，证实有长期的抗肿瘤免疫反应存在。此外，转染4-1BBL的肿瘤细胞接种小鼠后无肿瘤生长，并存在抵御肿瘤再次攻击的免疫力。研究还发现，融合蛋白Ig-4-1BBL与抗-4-1BB抗体一样能有效诱导肿瘤持续的特异性CTLs，治疗小鼠肝结肠癌。

另一方面，在治疗性疫苗的研究中证实，表达4-1BBL的重组痘病毒明显增强HIV疫苗诱导小鼠产生以IFN-γ应答为特征的特异性CD8⁺T细胞应答，这种作用在免疫后2个月仍能检测到。在CEA-转基因小鼠模型中，4-1BBL重组痘病毒明显增强表达B7.1和CEA的重组痘病毒疫苗的治疗作用，该作用与CEA特异性CD4⁺和CD8⁺T细胞应答水平增高相关。最近有报道，以包括4-1BBL在内的几种共刺激分子作为DNA疫苗的分子佐剂能诱导强大的细胞应答和回忆反应。以上结果均展示了4-1BBL在人类肿瘤和感染性疾病免疫治疗中的应用前景。

现有技术对4-1BBL蛋白的制备方法是直接从组织细胞提取，得率低、成本高。不能大量应用于体内试验或临床。

(三)发明内容

为了提高4-1BBL蛋白的得率，降低成本，为制备临床前试验用药或诊断试剂提供大量的原材料，本发明提供了一种采用4-1BBL(TNFSF9，NP_033430.1)胞外段蛋白的cDNA以基因工程方法制备含206个氨基酸残基(Arg 104-Glu 309)的重组4-1BBL蛋白的方法。

本发明采用的技术方案是：

一种4-1BBL蛋白的制备方法，所述方法包括：

(1)取含4-1BBL蛋白的小鼠淋巴细胞，conA体外刺激培养后经trizol裂解，抽提得到mRNA；所用原料为常规含4-1BBL蛋白的小鼠淋巴细胞；

(2)将mRNA逆转录得到4-1BBL胞外段蛋白的cDNA；

(3)对步骤(2)所得cDNA进行PCR扩增，得到4-1BBL蛋白目的基因；PCR扩增引物为：上游引物：5’-CTC GAG AAA AGA AGAACC GAG CCA AGA CCT-3’，下游引物：5’-GAA TTC TTC CCATGG ATT ATC AGG-3’；

(4)将步骤(3)PCR产物用Xho I和EcoR I双酶切后定向插入经同样双酶切的ppic9，获得重组质粒ppic9-4-1BBL；

(5)将重组质粒ppic9-4-1BBL转化至大肠杆菌DH5α，经培养扩增、抽提纯化、测序分析，获得测序正确的重组质粒；

(6)将测序正确的重组质粒转化至甲醇酵母菌，诱导表达重组蛋白；

(7)将表达重组蛋白的活化菌株进行诱导发酵培养，发酵液离心，取上清液分离纯化，得到纯化的4-1BBL重组蛋白。