[发明专利]一种杯苋甾酮的制备方法

说明书

技术领域：

本发明属于天然植物提取领域，具体涉及一种杯苋甾酮的制备方法。

背景技术：

川牛膝为常用中药，是著名的川产道地中药材。具有逐瘀通经、通利关节、利尿通淋之功效，用于经闭癥瘕、胞衣不下、跌扑损伤、风湿痹痛、足痿筋挛、尿血血淋。川牛膝的主要成分为生物碱和甾醇类物质，如杯苋甾酮、头花蒽草甾酮、促脱皮甾酮、红甾酮等，另外还有阿魏酸。川牛膝的主要药理作用有活血通经、祛风湿、通利关节、利尿通淋，以及对高血压性心脏病和痛经等疾病的治疗作用。

杯苋甾酮(cyasterone)分子式C₂₉H₄₄O₈，分子量520.65，mp.168-173℃，为无色针状结晶。杯苋甾酮在白毛夏枯草和川牛膝均有分离得到，但在川牛膝中的含量较高。T.Konoshima等报道，从白毛夏枯草中分离得到的杯苋甾酮对由肿瘤细胞生长促进剂12-O-te-trade canoylphorbo 1-13-acetate(TPA)诱导产生的Epstein-Barr病毒早期抗原(EBV-EA)具有强烈的抑制作用，并显出潜在的抗肿瘤活性。黎万寿等研究发现杯苋甾酮对去势小鼠的体重和子宫系数有增加趋势，子宫湿重有显著增长，提示其为川牛膝的雌激素样活性的有效成分；杯苋甾酮能增加去势大鼠提肛肌重量，提示其有蛋白质同化作用；实验结果表明，杯苋甾酮的药理活性与川牛膝强筋健骨“其滋补之功如牛之多力也”相符，与中医临床用药功能主治基本吻合。

目前主要采用溶剂萃取、常压反复硅胶柱层析或氧化铝柱层析进行分离，存在产量小、得率低、生产周期长等问题，不适用于工业生产。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种杯苋甾酮的制备方法，该方法操作简单、得率高、安全环保，可快速大量分离高纯度杯苋甾酮。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

(1)提取：取川牛膝药材粉碎成粗粉，加甲醇或乙醇加热至65℃-85℃，恒温浸泡2-4小时，滤出，滤液减压回收得川牛膝浸膏；

(2)大孔树脂柱富集：将川牛膝浸膏过大孔吸附树脂柱，用水和乙醇洗脱，醇洗脱液浓缩后得到浓缩液；

(3)制备液相分离：取一定量的浓缩液，用甲醇溶解上反相C18色谱柱，用乙酸乙酯-甲醇或氯仿-甲醇作为流动相，梯度洗脱，紫外检测器检测流出液，根据所得的色谱图收集杯苋甾酮组分，将洗脱液旋转蒸发浓缩，得杯苋甾酮粗晶；

(4)重结晶：将杯苋甾酮粗晶用庚烷-丙酮重结晶，冷冻干燥得到高纯度杯苋甾酮晶体。

步骤(2)所述大孔树脂可选D1300、AB-8、D101、HPD100等非极性或弱极性大孔吸附树脂。

步骤(2)所述大孔吸附树脂洗脱用乙醇溶液体积百分比为70-80％，洗脱用量为原药材的6-12倍。

步骤(3)所述流动相乙酸乙酯-甲醇中甲醇的体积百分比为20-80％。

步骤(3)所述流动相氯仿-甲醇中甲醇的体积百分比为20-80％。

步骤(3)所述洗脱梯度程序如下：

色谱柱填料为C18，流动相为乙酸乙酯或氯仿(A)和甲醇(B)，洗脱梯度见下表，流速为2-10ml/min，柱温为室温。

步骤(4)所述庚烷-丙酮的体积比为5-7∶1。

本发明的优点在于：1)操作简单、耗时短，易于产业化放大；2)提取、柱层析、制备液相分离等步骤中的溶剂用量少，并可回收再利用；3)具有较高的经济效益和学术价值，本发明所得产品纯度高，可为杯苋甾酮的进一步开发提供药理原料和实践支持。

具体实施方式：

下面结合具体实施例对本发明进一步说明：

实施例1：

(1)提取：

称取5kg川牛膝根粗粉，按1∶5的质量比加入90％的乙醇溶液，加热至65℃后恒温浸泡4小时，过滤除渣，滤液减压回收得川牛膝浸膏。

(2)大孔树脂柱富集：

将步骤(1)的浸膏通过D1300大孔吸附树脂柱，先用水洗至洗出液无色，洗液弃去，再用原药材6倍量的70％乙醇进行洗脱，收集洗脱液，减压浓缩后得到浓缩液。

(3)制备液相分离：

采用填料为C18的色谱柱，流动相为乙酸乙酯(A)和甲醇(B)，流速为2ml/min，检测波长为246nm，室温下操作，梯度洗脱程序如下：