[发明专利]采用秀丽线虫检测可溶性重金属持久性毒性的方法

说明书

技术领域

采用秀丽线虫检测可溶性重金属持久性毒性的方法，涉及一种采用秀丽线虫对可溶性重金属进行涵盖多个连续世代的持久性暴露，从而检测该重金属在长期、低浓度条件下的毒性效应的方法。属于环境保护、生态毒理学研究、生态风险评价等技术领域。

背景技术

秀丽线虫(Caenorhabditis elegans)对外界环境的变化非常敏感，环境胁迫会改变它们的生殖速度、生命周期等发育特征以及其他行为学特征。毒理学研究经常采用秀丽线虫作为毒性测试模式动物，但是对于低浓度、连续性地暴露多个世代周期的持久性毒性的研究并没有先例。

用秀丽线虫测定药品与个人护理品类物质世代毒性的方法已经有所研究，其方法涉及不同世代的秀丽线虫经过相同的暴露后的效应之间的比较，虽然能够对重金属在世代之间的毒性效应得到一定的比较结果，但是该效应及其比较结果相对于真实环境依旧存在差异和不足，主要表现在：其一，暴露时间的不连续，每一世代的线虫其生命周期只有某一段时间接受暴露，并不是全生命阶段的暴露，尤其是没有涵盖秀丽线虫对外界环境变化更加敏感的、从虫卵到成虫的发育阶段；其二，并不能够反映实际环境下食物与重金属共存的真实条件，已有研究表明，食物能够改变秀丽线虫对重金属的响应，不考虑食物对秀丽线虫的影响并不能够为真实环境条件下的风险进行有力的说明。

发明内容

本发明的目的是公开一种采用秀丽线虫检测可溶性重金属持久性毒性的方法，具体是以虫卵作为起始受试生物，确定了不影响虫卵正常孵化的虫卵起始浓度，以及能够满足其生长发育所需的食物起始浓度，在暴露时间、暴露剂量尤其是食物与重金属共存等方面更加贴近实际环境暴露情形，与现有采用秀丽线虫进行毒性测试方法比较，具有明确的针对性，对模拟实际环境暴露情形下的毒性研究方法进行了补充和扩展。

为了达到上述目的，本发明采用秀丽线虫对重金属进行涵盖多个连续世代的持久性暴露，从而检测该重金属在长期、低浓度条件下的毒性效应。本发明确定了不影响虫卵孵化的虫卵起始浓度，以及能够满足其生长发育所需的食物起始浓度，在暴露时间、暴露剂量尤其是食物与重金属共存等方面更加贴近实际环境暴露情形。本发明所用秀丽线虫以及E.coli OP50均由复旦大学发育生物学研究所惠赠。具体包括如下步骤：

A，依照传统急性毒性测试方法，以秀丽线虫成虫作为受试生物，测得该可溶性重金属的急性LC₅₀值，在急性LC₅₀值的1/10下设置4个浓度梯度，其中包括3个重金属浓度，1个空白对照；其中，测定LC₅₀的具体步骤是：按照B步骤获得同步化的卵液，在覆有E.coli OP50并37℃培养过24h的NGM固体培养基上，置于20℃培养48h，获得同步化的秀丽线虫成虫，然后以96孔板为染毒环境，向每孔中加入15条秀丽线虫成虫，染毒24h后采用体视显微镜对96孔板中的秀丽线虫进行观察，虫体僵直且对轻微触碰无反应则认定其死亡，分别记录秀丽线虫成虫的总数与死亡数，计算死亡率；若所设定的浓度梯度没有同时涵盖30％至70％的死亡率，则根据情况调整重金属的浓度梯度：若所设定的浓度梯度所产生的死亡率均小于70％，则保持空白对照不变，将重金属浓度梯度中的最低浓度不变，增加所采用的等对数间距，设定较高的浓度梯度；若所设定的浓度梯度所产生的死亡率均大于30％，则保持空白对照不变，将重金属浓度梯度中的最高浓度不变，增加所采用的等对数间距，设定较低的浓度梯度。然后再次以96孔板为染毒环境，向每孔中加入15条秀丽线虫成虫，染毒24h后采用体视显微镜对死亡率进行观察；重复此操作直至获得的死亡率同时涵盖30％至70％，然后以浓度对数为横坐标、死亡率为纵坐标，采用直线内插法获得其急性LC₅₀值；