[发明专利]基于纤维素柱的疟原虫子孢子分离方法

说明书

技术领域

本发明涉及寄生虫领域，特别涉及疟原虫子孢子的分离技术。

背景技术

疟原虫（plasmodium）寄生于人及多种哺乳动物，目前已知有130余种。人体疟原虫的生活史，需要人和雌性按蚊做宿主，疟原虫在人体内先后经在肝细胞和红细胞内发育。在肝细胞内为裂体增殖，称红细胞外期（红外期）；在红细胞内发育包括红细胞内裂体增殖期（红内期）和配子体形成的有性期开始。

蚊唾液腺内含有疟原虫子孢子的雌性按蚊刺吸人血时，感染性子孢子随蚊的唾液进入人体，经血液循环约30分钟孢子侵入肝细胞导致疟疾感染。虫体经红外期、红内期发育致疟疾发病。子孢子入侵肝细胞是由于子孢子表面有一种蛋白（环子孢子蛋白，CSP）能与肝细胞表面的疟原虫受体相结合，使两者接触。然后，子孢子释放由棒状体内贮存的分泌物，作用于接触的肝细胞膜，而主动侵入肝细胞。一个蚊唾液腺内可含有1000～10000个子孢子。疟原虫子孢子呈梭形，长约10～15μm，宽约1μm。在疟疾的实验研究中，,有时需大量有感染力的子孢子，但感染按蚊分离和纯化子孢子较困难。现有技术中已公开了一种锥形试管低速离心分离蚊虫体内子孢子的快速、简单方法，具体为：取一支0.5mL的锥形管，用热的20号皮下注射针在其底部穿一小孔，塞以小块的玻璃棉，放入另1支1.5ml的锥形试管中。将去头蚊体放入锥形试管中，离心2-3分钟，从蚊体组织和碎片中滤出的子孢子集中在锥形试管中形成一个球状物。该方法分离按蚊数量有限（约30－50蚊/管）；分离效率低（约20－30％）；含大量蚊的碎片，影响其后的实验结果等。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种疟原虫子孢子的分离方法，该方法将专用层析柱分离法和梯度离心法相结合，其分离效果好，适用于大规模分离、纯化疟原虫子孢子。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

1、基于纤维素柱的疟原虫子孢子分离方法，具体包括以下步骤：

A、预处理

将含有疟原虫子孢子的按蚊匀浆液离心，收集上清液，并对疟原虫子孢子计数，得子孢子匀浆液;

B、纤维素柱（Diethylaminoethyl cellulose， DE 52）分离疟原虫子孢子

将步骤A所得子孢子匀浆液与缓冲液以体积比1:1－3的比例混合，得子孢子匀浆稀释液，将所述子孢子匀浆稀释液在重力作用下过纤维素柱，流速为5-7mL/分钟，收集洗脱液，所述洗脱液中含有疟原虫子孢子。

2、根据1所述的基于纤维素柱的疟原虫子孢子分离方法，步骤B所述纤维素柱包括底部开孔4的中空柱体1，柱体内从下至上依次填充有玻璃纤维层2和DE 52纤维素层3。

3、根据2所述的基于纤维素柱的疟原虫子孢子分离方法，所述纤维素柱的DE 52纤维素层包括缓冲液和经过缓冲液充分浸泡的DE 52纤维素。

4、根据1所述的基于纤维素柱的疟原虫子孢子分离方法，步骤A预处理具体为：将含有疟原虫子孢子的按蚊匀浆液经离心机中100rpm/3-4g离心30 秒，700-800rpm/25g离心5分钟，在2000-2500rpm/700g离心20分钟后，再以1:1-3置于199或DMEM培养基中,内含有体积浓度为35%牛白蛋白液，用细胞计数器对疟原虫子孢子进行计数，使疟原虫子孢子浓度为1×10⁵个/ml，即为获得的子孢子匀浆液。

5、根据1所述的基于纤维素柱的疟原虫子孢子分离方法，步骤B预处理具体为：将步骤A所得子孢子匀浆液置于冰上，孵育至少30分钟，然后置于室温，与缓冲液以体积比1:1的比例混合，得子孢子匀浆稀释液，将所述子孢子匀浆稀释液在重力作用下过纤维素柱，流速为5-7mL/分钟，收集洗脱液5，所述洗脱液中含有疟原虫子孢子。

本发明的有益效果在于：建立一种纯化分离雌性按蚊体内疟原虫子孢子的技术;该技术的子孢子分离率达70～80%;并保持疟原虫子孢子感染活力和抗原性，可用于实验性研究。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中：

图1为纤维素柱的结构示意图；

图2纯化的约氏疟原虫的唾液腺子孢子染色图，吉氏染色 100×；

图3相差显微镜观察纯化的约氏疟原虫的唾液腺子孢子，60×。

.具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明的优选实施例进行详细的描述。

实施例1 蚊胸部疟原虫子孢子纯化、分离方法

一、收获约氏疟原虫子孢子