[发明专利]一种断端对接式发夹型DNA探针

说明书

技术领域

本发明涉及生物分子诊断和生物芯片技术领域，具体涉及一种断端对接式发夹型DNA探针。

背景技术

发夹型DNA探针(原始结构又叫分子信标molecular beacon)是根据核酸碱基配对原则和荧光共振能量转移(fluores-cence resonance energy transfer，FRET)现象设计、常温下空间结构上呈茎环结构的一种DNA分子探针。环序列与靶核酸互补；茎由与靶序列无关的互补序列结合构成；两末端分别标记荧光/淬灭分子。荧光FRET现象：常温下发夹探针呈完整茎环结构时(折叠发夹状态)，荧光/淬灭分子接触紧密，因淬灭作用荧光信号很弱(抑光态)；当温度升高或环序列与靶序列结合后，茎环打开(展开状态)，荧光/淬灭分子对分离，淬灭作用减弱，荧光信号较强(发光态)；温度下降可复原，呈现随温度变化引起的可逆循环：“展开发光态-折叠抑光态”。发夹探针这种折展状态导致“荧光释放-抑制”与温度和靶序列等高度相关。与常规线型核酸探针相比，随结构变化而引起荧光信号显著改变的发夹探针具有明显优势：1.非常的高特异性和灵敏度：发夹探针对单个碱基错配、缺失或插入突变具有更强的检测能力，特别适用于SNP位点(单核苷酸多态性)一类的单碱基改变检测；2.性能稳定可重复使用等。目前常作为游离态探针应用于荧光定量PCR、活体内核酸检测等无固载技术领域。

生物固载技术指生物分子(如探针等)固定在芯片、磁珠、微球等载体表面作识别探针的技术，核心是探针分子。发夹探针素有“光开关”之称，折-展状态与靶环单碱基匹配程度高度关联，设计严密的发夹靶环错一个碱基也不能打开茎环，因此特别适用于单硷基位点检测。但长久以来受结构限制(探针两末端分别修饰荧光-淬灭分子对而占用，缺少一个连接臂固定在载体表面)，常为游离状态的发夹探针在芯片在固载表面的固定难题一直制约着其在生物固载领域的运用，并严重影响其优越性能发挥。为解决固定难题，按常规思路需要加一条连接臂与载体连接，环不能动，国内外学者只能在探针的茎臂上修饰，这也是目前的主研方向。茎臂修饰的发夹探针(国内外报道最多见)是茎臂修饰生物素方式：生物素(biotin)修饰到探针茎臂，亲和素(avidin)固定到芯片表面，通过biotin-avidin结合力固定，问题：1，发夹探针茎臂修饰有很高技术难度。2，茎臂修饰生物素的游离态发夹探针与芯片表面亲和素结合无特异性：难以应用检测多分子，国外有少量研究报道目前主要限于单分子检测。另一种中间修饰方式：茎臂单侧延长末端修饰固定、与互补链荧光素对应中间位置修饰淬灭分子以达到荧光淬灭效应。但仍然存在两个问题：1，发夹探针的茎臂中间修饰淬灭素分子仍然存在较高技术难度和较高的修饰合成成本；2，中间标记对荧光分子(或淬灭分子)本身具有高选择性，许多性能优良的常用荧光分子由于技术原因无法中间修饰，从而影响到使用。以上“茎臂修饰”(即中间修饰)都存在较高技术难度和修饰昂贵等痼疾；第二种还存在只能标记高选择性荧光/淬灭分子问题。

核心问题是解决发夹探针在固载表面的固定难题。我们对问题进行了深入剖析：荧光-淬灭分子对的距离远近引起的荧光共振能量转移(FRET)现象是发夹探针诸多优势的原始技术来源，因此设计原则上离不开荧光/淬灭这两个分子对，而要固定到固载支持物表面就必须还要接一个连接分子(如生物素/氨基/巯基等)。发夹探针展开后是一条完整的单链核酸(一般30-40bp)，只有两个末端(3′、5′端)；而荧光分子、淬灭分子、连接分子，这三个必须分开的大分子按照常规思路设计是无论如何也不能同时放到两端的，如果两末端分别修饰荧光/淬灭分子而占用，必然有第三个分子被“挤”在被占用的探针两末端以外，这就是造成国内外在该领域研究中必须要涉及核酸单链中间修饰的根本原因。这也是长期以来引起发夹探针固定难题及其运用的根本原因。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：避开“单链核酸中间修饰”这个常规思路设计，保证无靶序列存在时荧光-淬灭分子对紧邻(无荧光)、有靶序列存在并杂交后分离(发出荧光)，即保证荧光FRET现象前题下，把“荧光分子、淬灭分子、连接分子”三者放到发夹探针上，更充分发挥发夹型DNA探针的优势。

为解决上述技术问题，本发明提供一种将荧光素及淬灭素分段标记的断端对接式发夹型DNA探针，其技术方案如下。