[发明专利]检测土拉弗朗西斯菌的试剂及复合探针荧光定量PCR检测土拉弗朗西斯菌的方法

说明书

技术领域

本发明涉及检测土拉弗朗西斯菌的试剂及土拉弗朗西斯菌的检测方法，尤其涉及复合探针土拉弗朗西斯菌标识基因进行扩增，进而利用复合探针荧光PCR技术检测土拉弗朗西斯菌的方法。

背景技术

土拉弗朗西斯菌(Francisella tularensis)是一种革兰氏阴性球杆菌，能引起人畜共患的土拉菌病(Tularemia)，是最具传染性的致病菌之一，在自然界中已发现一百种以上的动物感染此菌。因其传播途径多样，易扩散、毒性强而被美国疾病控制预防中心列入A类生物恐怖制剂。土拉菌病致死率非常高，毒力最强的A型土拉热亚种在缺乏有效治疗的情况下，感染10个细菌就可致命。因此及时、准确的检测土拉菌对于土拉菌病患者及时治疗和防止扩散具有重要的意义。土拉弗朗西斯菌生长缓慢，可通过气溶胶传播，细菌培养诊断难度较大，通常采用免疫学或者分子生物学方法，如微凝集实验、酶联免疫吸附、快速检测试纸条、生物传感器、PCR、核酸杂交检测、质谱分析、基因芯片等。但到目前为止还没有一种成熟的用于土拉菌检测方法，其主要原因在于土拉菌致病性强，且不易分离培养。

传统PCR技术和核酸杂交技术的发现大大的推动了细菌检测技术的发展，但存在容易交叉污染、无法定量分析等缺陷。实时荧光定量PCR技术解决了传统PCR技术的不足，已经成为细菌等微生物快速定量检测的首选技术。定量PCR技术可在同一管内实现DNA的扩增和同步检测，而无需在PCR后进行凝胶电泳分析，具有高效、快速、特异的优点，非常适用于单一病原体的检测。Taqman探 针、分子信标、杂交探针(Lightcycler)等用广泛应用于传染病病原体监测、食品安全、卫生检疫等领域中。发展快速、敏感、特异、系统的病原微生物的筛查技术、方法和试剂，发展先进、系统的病原微生物分离和检测方法，可以有效地对传染病的暴发和流行进行早期预警、快速确认，控制新发传染病的口岸传入，并可有助于提高对突发公共卫生事件、暴发疫情和不明原因疾病的快速应急反应和处理能力。

发明内容

本发明的第一个目的在于针对当前常规土拉弗朗西斯菌检测方法还不完善，提供一种检测土拉弗朗西斯菌的试剂，可以用于快速准确地检测土拉弗朗西斯菌。为此，本发明采用以下技术方案：它包括以下上游引物、下游引物、荧光探针和淬灭探针；

上游引物的基因序列FTF1为：5′-aagcaagtgttgactacagat-3′，其基因序列如序列表SEQ：NO 1所示；

下游引物的基因序列FTR1为：5′-caccaaagaaccatgttaaac-3′，其基因序列如序列表SEQ：NO 2所示；

荧光探针的基因序列FPFT1为：5′-FAM-aatcatgttagtacccgctctgcca-P-3′，其基因序列如序列表SEQ：NO3所示；

淬灭探针的基因序列QPFT1为：5′-agcgggtactaacatgat-Dabcyl-3′，其基因序列如序列表SEQ NO：4所示。

本发明另一个目的是提供一种复合探针荧光定量PCR检测土拉弗朗西斯菌的方法，可以快速准确地检测土拉弗朗西斯菌。为此，本发明采用以下技术方案：

它采用直接水煮法提取土拉弗朗西斯菌基因DNA：取50μl的细菌样品，置于沸水浴中煮沸10分钟，10000×g离心2分钟，取2μl上清作为扩增PCR模板；

所述方法的PCR反应体系为25μl：10mmol/L的Tris-HCl，pH为8.0；50mmol/L的KCl；体积百分比3％甲酰胺；6mmol/L MgCL₂；100μmol/L的dATP、 dCTP、dGTP、dTTP；0.5μmol/L的上述上游引物，0.5μmol/L的上述下游引物，1.5U Taq酶，100nmol/L的上述荧光探针，200nmol/L的上述淬灭探针；PCR反应程序为：预变性95℃3min、95℃5s、扩增的退火温度为54℃30s共40个循环；

所述方法还包括以下检测步骤：将扩增模板按上述荧光定量PCR的反应体系及反应程序在实施荧光定量PCR仪上进行扩增，并同时进行阴性对照和阳性对照的扩增，其中阴性对照采用非土拉弗朗西斯菌，阳性对照采用土拉弗朗西斯菌标准株；反应结束后，将样本循环阈值C(t)与荧光定量PCR标准曲线对照，就得到样本DNA中的靶基因片段拷贝浓度；按照靶基因片段拷贝浓度判断样本中土拉弗朗西斯菌的浓度。