[发明专利]抗感染中药成分的筛选方法

权利要求书

1.一种抗感染中药成分的筛选方法，其特征在于筛选方法包括以下步骤：

(1)选取具有抗病毒、细菌、增强免疫活性的中药；

(2)试验用细胞的准备；

(3)Toll样受体(Toll-like receptors，TLRs)及其下游信号分子基因的调取；

(4)MTT药物毒性试验；

(5)Real-Time PCR检测中药对Toll样受体分子在mRNA水平上的影响；

(6)Real-Time PCR检测中药对Toll样受体分子下游分子MyD88和TRIF在mRNA水平上的影响；

(7)Real-Time PCR检测中药对IL-6、TNF-α和INF-β等细胞因子的影响；

(8)Western Blot检测Toll样受体蛋白的表达；

(9)报告基因转录活性检测。

2.根据权利要求1所述的抗感染中药成分的筛选方法，其特征在于：首先选取具有抗病毒、细菌、增强免疫活性的中药，将其用DMSO溶解，其储存液终浓度为20mg/ml。

3.根据权利要求1所述的抗感染中药成分的筛选方法，其特征在于：试验用细胞的准备，将试验用Ana-1小老鼠巨噬细胞株，RAW264.7小老鼠巨噬细胞白血病细胞株，293T人胚肾细胞株分别用含10％FBS的1640和DMEM培养基(100U/ml青霉素、链霉素)，37℃，5％CO₂，培养箱培养，2-3天细胞处于对数生长期时传代培养。

4.根据权利要求1所述的抗感染中药成分的筛选方法，其特征在于：选择Toll样受体分子和Toll样受体的下游分子MyD88和TRIF以及IL-6、TNF-α和INF-β作为待检分子，并分别对其部分基因序列进行了引物的设计、合成与鉴定，为Real-Time PCR做准备。

5.根据权利要求1所述的抗感染中药成分的筛选方法，其特征在于：MTT药物毒性试验，Ana-1细胞铺95孔板，10⁴个细胞/孔(200ul)，试验设中药感染组，DMSO阴性对照组，调零组，每组设6个感染剂量梯度(即80ug/ml，60ug/ml，40ug/ml，20ug/ml，10ug/ml，5ug/ml)，每个梯度设3个重复，待药物感染细胞24小时后，每孔加入5mg/ml的MTT20ul，于37℃反应4小时后，每孔加入150ul的DMSO溶解活细胞与MTT反应后产生的紫色结晶，于振荡10分钟待结晶完全溶解后选择570nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，得出药物浓度对细胞的抑制率，确定中药感染细胞的最佳剂量。

6.根据权利要求1所述的抗感染中药成分的筛选方法，其特征在于：初筛中药，通过Real-Time PCR检测中药对Toll样受体分子在mRNA水平上的影响、Real-Time PCR检测中药对Toll样受体分子下游分子MyD88和TRIF在mRNA水平上的影响、Real-Time PCR检测中药对IL-6、TNF-α和INF-β等细胞因子的影响、Western Blot检测Toll样受体蛋白的表达，筛选出经该中药刺激后具有高表达的中药品种。

7.根据权利要求1所述的抗感染中药成分的筛选方法，其特征在于：利用双荧光素酶报告基因系统测定中药刺激Toll样受体后对其下游NF-KB和INF报告基因转录活性的影响。