[发明专利]副猪嗜血杆菌实时荧光定量PCR检测方法

权利要求书

1.一种副猪嗜血杆菌实时荧光定量PCR检测方法，通过荧光染料嵌合PCR反应中所发出的荧光信号进行检测，其特征在于以登录号AB004028的副猪嗜血杆菌的16S rRNA基因序列为参考，其引物序列和扩增序列分别为：

引物序列1 5’-GAC GGG AAA CTG TCG CTA-3’

引物序列2 5’-CTA GAG ATC GTC GGC TTG-3’

扩增序列为序列表SEQ.ID.No.3的碱基序列。

2.根据权利要求1所述的副猪嗜血杆菌实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于所述方法包括如下步骤：

<1>制备DNA样本：取待检样本进行总DNA的提取纯化；

<2>实时荧光定量PCR反应：取步骤<1>所得DNA样本作为模板进行荧光PCR扩增，并同时分别以标准品DNA和去离子水为阳性对照样本和阴性对照样本进行荧光PCR扩增；

<3>建立标准曲线：取已知浓度的标准品DNA按10倍稀释法稀释成5×10⁷～5×10⁰拷贝/μL 8个浓度梯度，按步骤<2>的PCR反应体系和反应程序进行扩增，反应结束后，根据得到的各浓度梯度的循环阈值Ct绘制荧光定量PCR标准曲线；

将DNA样本的循环阈值Ct与标准曲线对照，得到待检DNA样本中的16S rRNA基因片段拷贝浓度，据此得到样本中的副猪嗜血杆菌的细菌数量。

3.根据权利要求2所述的副猪嗜血杆菌实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于所述荧光定量PCR反应的反应体系、扩增程序和测定扩增片段的熔解程序分别为：

反应体系：PCR混合液20μL，其中SYBR Green I Mix 9μL、5pmol/μL的上下游引物各0.3μL、DNA模板2.5μL以及去离子水7.9μL；

扩增程序：95℃5min，随后进行40个循环，每个循环包括95℃20s，62℃20s，68℃20s：

测定扩增片段的熔解程序：按每0.5℃/10s的升温速率从55℃升至95℃进行熔解曲线分析验证。