[发明专利]一种通过转DdICE1基因提高切花菊抗逆性的方法

权利要求书

1.一种通过转DdICE1基因提高菊花抗逆性的方法，其特征在于该方法包括以下步骤：

(1)构建DdICE1基因植物表达载体：以菊属异色菊cDNA为模板，设计引物进行PCR反应，在目的基因DdICE1的上游和下游分别引入Sal I和Not I酶切位点，上游引物DdICE1-gateway-F：SEQ ID NO.2，下游引物DdICE1-gateway-R：SEQ ID NO.3，PCR产物连接到pMD19-T Simple载体，转化TOP10感受态细胞，提取阳性质粒，将提取的阳性质粒由Sal I和Not I双酶切得到的DdICE1片段与Sal I和Not I双酶切的pENTR1A连接，转化，提取的阳性质粒经Nsi I单酶切线性化后与pEarleyGate103载体质粒进行LR重组反应，得到DdICE1基因植物表达载体pEarleyGate103-DdICE1，所述的DdICE1基因的序列为SEQID NO.1；

(2)采用农杆菌介导法将步骤(1)构建的DdICE1基因植物表达载体转入菊花中，进行培养初步获得抗性植株。

2.根据权利要求1所述的通过转DdICE1基因提高菊花抗逆性的方法，其特征在于步骤(2)中所述的采用农杆菌介导将DdICE1基因转入菊花的过程为：制备感受态的农杆菌，将步骤(1)中构建的DdICE1基因植物表达载体转入感受态的农杆菌中，挑选阳性克隆，摇菌至OD 0.5，离心后，弃上清，用MS(pH5.8)培养液将沉淀等体积悬浮，用于侵染；取组培瓶中菊花苗顶端叶盘作为转化受体，在预培养基中培养3d，然后浸入上述备好的转入了DdICE1的植物表达载体的农杆菌菌液中侵染8～10min，用滤纸吸干叶盘表面的菌液后再将其接种到共培养基上，暗培养3～5d，然后转入筛选培养基上继代培养3～4代，等分化出的抗性芽长至2～3厘米时转入生根培养基上培养，初步获得抗性植株。

3.根据权利要求2所述的通过转DdICE1基因提高菊花抗逆性的方法，其特征在于菊花组织培养基以MS培养基为基础，pH5.8，100Kpa、121℃灭菌20分钟；预培养培养基：MS+6-苄氨基嘌呤1mg/L+萘乙酸0.5mg/L；共培养培养基：MS+6-苄氨基嘌呤1mg/L+萘乙酸0.5mg/L；筛选培养基：MS+草胺磷20mg/L+羧卞青霉素500mg/L+6-苄氨基嘌呤1mg/L+萘乙酸0.1mg/L；生根培养基：1/2MS+草胺磷8mg/L+萘乙酸0.1mg/L。

4.根据权利要求1或2所述的通过转DdICE1基因提高菊花抗逆性的方法，其特征在于所用的农杆菌菌株为EHA105。