[发明专利]鉴别猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒传统毒株和高致病毒株的荧光PCR检测方法

说明书

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，公开了一种鉴别猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒传统毒株和高致病毒株的荧光PCR检测方法。

背景技术

猪繁殖与呼吸系统综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)俗称“蓝耳病”，是一种由猪繁殖与呼吸系统综合征病毒(PRRSV)引起的以母猪繁殖障碍和仔猪的呼吸道征状，以及高死亡率为特征的高度接触性传染病。1987年该病首次爆发于美国，世界各国也相继呈流行性感染，给世界养猪业造成了巨大的损失。该病于2006年在我国大部分省份开始流行起来，即所谓的“猪无名高热”，给我国养猪业造成了巨大的损失。PRRSV的变异分为基因组变异和抗原性变异两类，PRRSV的nsp2(非结构蛋白)基因具有非常高的变异性，如HB-2株和MN184株在该区分别缺失了12个和100多个氨基酸，sp184212株则在该区插入了30多个氨基酸。从我国患病猪体内提取到的高致病性PRRSV进行全基因测序后发现在nps2基因片段存在约80个碱基序列的缺失，推测nsp2基因缺失为高致病性PRRSV的毒力增强的重要原因。传统的PCR方法不能对样品进行精确的定量测定，并且在时效性上存在一定的不足。

发明内容

本发明的目的是针对上述现有技术的缺陷，提供了一种根据PRRSV变异毒株在nsp2存在86个碱基的缺失这一特点建立一种利用荧光PCR方法快速检测nsp2基因缺失变异毒株的方法，具有操作方便、敏感性强、特异性好的优点。

为了实现上述目的本发明实施例采取的技术方案是：

鉴别猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒传统毒株和高致病毒株的荧光PCR检测方法，包括如下步骤：

(1)准备材料：

提供已克隆PRRSV高致病性毒株TJ-H1和传统株TJ-H3的nsp2基因的质粒TJ-H1nsp2-T和TJ-H3 nsp2-T，并提取该质粒的DNA；

(2)设计引物：

运用DNAMAN软件对nsp2基因缺失的PRRSV高致病性毒株TJ-H1与传统株TJ-H3的nsp2基因的核苷酸序列和GenBank数据库中其他株PRRSV的nsp2基因序列进行比对，找出缺失部分的核苷酸序列和所有参与比对的PRRSV株的nsp2基因序列高度保守区域，利用Primer Premier5.0引物设计软件，在缺失区域上游的高度保守区域设计一条上游引物nsp2-1，在缺失区域设计一条下游引物1nsp2-2，在缺失区域下游的高度保守区域设计一条下游引物2nsp2-3；

(3)PCR反应体系及其反应程序和参数的优化

分别以TJ-H1 nsp2-T和TJ-H3 nsp2-T质粒DNA为模板，对退火温度、循环次数、引物浓度及双重PCR反应中三条引物的最佳浓度配比进行优化，确定PCR反应的最佳条件；

(4)检测最佳PCR反应条件下的PCR反应特异性和敏感性

利用步骤(3)优化的PCR反应的最佳条件，以TJ-H1nsp2-T和TJ-H3nsp2-T质粒DNA为模板，各自分别用nsp2-1，nsp2-2引物对、nsp2-1，nsp2-3引物对和nsp2-1，nsp2-2，nsp2-3引物对进行扩增，确定PCR反应的特异性；

将TJ-H1nsp2-T质粒DNA进行10倍梯度稀释后作为模板，各自用nsp2-1，nsp2-3引物对进行扩增；以及，将TJ-H3 nsp2-T质粒DNA进行10倍梯度稀释后作为模板，各自分别用nsp2-1，nsp2-3引物对、nsp2-1，nsp2-2，nsp2-3引物对进行扩增，确定PCR反应的灵敏性。

(5)实时荧光定量聚合酶链反应(Real-time FQ-PCR)，建立标准曲线

利用步骤(3)优化的PCR反应体系，将已知拷贝数的TJ-H3 nsp2-T质粒DNA进行10倍梯度稀释作为模板，各自用nsp2-1，nsp2-2引物对、nsp2-1，nsp2-3引物对和nsp2-1，nsp2-2，nsp2-3引物对进行实时荧光定量PCR扩增；以及将已知拷贝数的TJ-H1 nsp2-T质粒DNA进行10倍梯度稀释作为模板，各自用nsp2-1，nsp2-3引物对进行实时荧光定量PCR扩增，扩增反应的程序和参数为：95℃10min，1个循环；95℃15s，57℃45s，40个循环，得到相应的熔解曲线，最后进行标准曲线的绘制，以模板起始拷贝数的对数值(横坐标)对PCR反应的Ct值(纵坐标)作图，建立标准曲线；