[发明专利]南洋臀纹粉蚧的实时荧光PCR引物、探针及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及南洋臀纹粉蚧的实时荧光PCR引物、探针及检测方法。

背景技术

南洋臀纹粉蚧Planococcus lilacinus (Cockerell)是“中华人民共和国进出境植物检疫性有害生物名录”中的有害生物，同时也是欧洲、美洲等许多国家或地区十分关注的检疫性有害生物。南洋臀纹粉蚧是东南亚地区分布较广，为害严重的重要有害生物。该虫寄主植物较多，已记载寄主植物达35个科共100余种，为害多种水果、林木和观赏植物。主要寄主植物有榴莲、甘橘、芒果、番石榴、番荔枝、番樱桃、龙眼、红毛丹、石榴、槟榔、山菠萝蜜、刺桐、可可、羊蹄甲、巴蕉、桃榄等多种水果和林木。南洋臀纹粉蚧极易随上述寄主植物传入我国，对我国的农业生产构成潜在威胁，因此，需要在口岸检疫部门严格加强检疫工作，防止该虫传入我国。

在蚧虫鉴定中，只有成熟、完整的雌成虫才能进行准确的形态鉴定，若口岸截获到若虫，必须花费较长时间将其饲养为成虫；若截获到不完整的死虫，根本无法鉴定其种类。蚧虫鉴定前，需先将其制作成玻片标本。制作玻片标本的技术性较强，制作人员需经专门培训，才能制作出合格的标本。蚧虫鉴定十分困难，需要经验丰富的蚧虫专家才能准确鉴定其种类。本发明弥补了蚧虫形态学鉴定的不足，可以更为快捷、准确地鉴定出口岸截获的蚧虫是否为南洋臀纹粉蚧。

发明内容

本发明的目的在于提供南洋臀纹粉蚧的实时荧光PCR引物、探针及检测方法，旨在解决蚧虫形态鉴定耗时长、鉴定困难的问题。

本发明的技术方案如下：

一种用于检测南洋臀纹粉蚧的实时荧光PCR引物，其中，所述引物的核苷酸序列如SEQ NO.1和SEQ NO.2所示。

一种用于检测南洋臀纹粉蚧的实时荧光PCR的MGB探针，其中，所述MGB探针是一段两端分别用不同的染料标记的寡核苷酸，在5’端标记一个报告荧光基团，3’端标记一个淬灭基团和一个MGB基团，所述寡核苷酸的序列如SEQ NO.3所示。

所述的用于检测南洋臀纹粉蚧的实时荧光PCR的MGB探针，其中，所述报告荧光基团为荧光染料FAM，所述淬灭基团为非荧光淬灭基团。

一种检测南洋臀纹粉蚧的实时荧光PCR方法，其中，包括以下步骤：

1）先对南洋臀纹粉蚧及其近似种转录间隔区进行序列测定及比较分析，分别找出南洋臀纹粉蚧不同于其它近似种的独有的碱基位点，然后设计用于南洋臀纹粉蚧实时荧光PCR检测的上游引物、下游引物和MGB探针；

2）提取待测样品DNA;

3）设置实时荧光PCR的反应体系：5μl 2×TaqMan^? Gene Expression Master Mix，10pM的上游引物和下游引物各0.25μl，10pM的MGB探针0.2μl，待测样品DNA 1μl，加水补足总体积10μl；同时设置阳性对照、阴性对照和空白对照；

4）进行实时荧光PCR反应，并检测荧光信号：反应条件为50℃，2min；95℃，10min；95℃，10s；60℃，1min；40个循环；

5）根据荧光信号的检测结果，判断是否为南洋臀纹粉蚧。

所述的检测南洋臀纹粉蚧的实时荧光PCR方法，其中，所述阳性对照为南洋臀纹粉蚧DNA，阴性对照为大洋臀纹粉蚧DNA、甘蔗簇粉蚧DNA、新菠萝灰粉蚧DNA、李比利氏灰粉蚧DNA、气生根粉蚧DNA、双条拂粉蚧DNA，空白对照为去离子水。

本发明的有益效果：设计了适用于南洋臀纹粉蚧实时荧光PCR快速检测的引物和寡核苷酸探针，克服了现有形态学鉴定方法检测周期长、需要制作玻片标本和需要丰富经验的缺点，也克服了现有的分子检测方法操作复杂或检测灵敏度不高、特异性不强、重复性不好等缺点；由于本发明检测快速、特异性强，特别适用于口岸检疫等时效性要求较强的场合使用。

附图说明

图1是本发明实施例中实时荧光PCR检测南洋臀纹粉蚧的荧光信号结果图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚、明确，以下参照附图并举实施例对本发明进一步详细说明。