[发明专利]甘蔗白叶病病原巢式PCR检测方法

说明书

技术领域：

本发明涉及植物保护领域，尤其是一种快速、简便、高效的甘蔗白叶病病原的检测方法。

背景技术：

甘蔗白叶病由类菌原体侵染所引致，属全株性病害，也是一种重要的检疫性病害。主要分布在中国台湾，泰国、澳大利亚和新西兰。症状主要表现为在叶片上有单条或数条白色或乳黄色或浅绿色条纹，严重时整个全叶丧失叶绿素变成白色，呈漂白状，植株矮化，节间短缩，分蘖增多。类菌原体可通过带病种苗进行传播，在田间叶蝉(Matsumuratetlix hiroglyhious)等昆虫介体可通过取食病株韧皮部进行反复侵染传播。该病害是甘蔗产业毁灭性病害之一，可导致甘蔗的巨大减产，给甘蔗和制糖产业带来巨大损失。

近年来，与大湄公河次区域(GMS)国家合作的逐渐增强，并且与这些国家开展甘蔗品种/材料交换日益频繁。由于甘蔗白叶病在GMS国家普遍发生，为了有效防控该病害随引进的甘蔗品种/材料侵入境内，对国际合作中进出口的甘蔗品种/材料进行病害检疫检测非常必要，因此建立一种快速有效的检测甘蔗白叶病的方法迫在眉睫。

发明内容：

本发明提出一种甘蔗白叶病病原巢式PCR检测方法，能够快速、简便、高效地检测甘蔗白叶病病原。本发明按下列步骤进行：取甘蔗病叶组织，通过CTAB法提取甘蔗病叶组织的总基因组DNA，应用巢式PCR技术对总基因组DNA依次进行第一轮PCR和第二轮PCR两次扩增，用1.0％的琼脂糖凝胶对巢式PCR扩增产物进行电泳检测，第一轮PCR扩增产物的DNA目标片段大小约为700bp，第二轮PCR扩增产物的DNA目标片段大小约为210bp。

所述的甘蔗病叶组织经液氮研磨成粉末，转入离心管，采用CTAB抽提缓冲液提取甘蔗病叶组织的总基因组DNA。

所说巢式PCR技术的两次扩增，第一轮PCR扩增采用的引物为MLOX/MLOY，第二轮PCR扩增采用的引物为P1/P2。

本发明通过应用巢氏PCR方法对样本进行检测，通过反复试验，建立了快速准确的检测方法，从而为严格防控该病害传入境内提供有力的技术保障。本方法具有快速、简便、高效等特点。

具体实施方式：

下面通过实施例对本发明的具体实施方式进行详细说明：

实施例步骤如下：

A、蔗叶总DNA的提取。

1、取新鲜叶片剪细，加入液氮研磨成粉末，转入2.0mL离心管；

2、加1000μL CTAB抽提缓冲液，于65℃水浴温育30min，每10min混匀一次，12000rmp离心10min；

3、取上清液800μL于2.0mL离心管，加等体积氯仿/异戊醇(24∶1)，混匀，12000rmp离心10min；

4、取上清液750μL于2.0mL离心管，加入2/3体积异丙醇，加入200μL 5MNaCl溶液，混匀，于-20℃放置4小时，12000rmp离心5min；

5、弃上清液，于沉淀加入500μL 70％乙醇，12000rmp离心2min；

6、弃上清液，于沉淀加入500μL无水乙醇，12000rmp离心2min；

7、弃上清液，室温干燥DNA，加40μL灭菌超纯水或TE缓冲液，于-20℃保存备用。

B、引物设计。

应用两对引物对DNA模板进行巢式PCR扩增。第一轮PCR扩增引物序列为：上游引物MLOX：5′-GTT AGG TTA AGT CCT AAA ACG AGC-3′，下游引物MLOY：5′-GTG CCA AGG CAT CCA CTG TAT GCC-3′，目标片段约为700bp；第二轮PCR扩增引物序列为：上游引物P1：5′-GTC GTA ACAAGG TAT CCC TAC CGG-3′，下游引物P2：5′-GGT GGG CCT AAA TGG ACTTGA ACC-3′，目标片段约为210bp。

C、巢式PCR扩增反应。