[发明专利]防治刺参腐皮综合症的噬菌体及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及对两种噬菌体及其应用，尤其能特异性裂解哈维氏弧菌(Vibrioharveyi)的噬菌体及其应用。属于生物工程领域。

背景技术

哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)是在海洋及盐湖环境中分布极为广泛的一种致病性嗜盐细菌。存在于近海岸的海水、海底沉积物以及鱼类、贝类之中。哈维氏弧菌是鱼虾贝等水产经济动物的主要致病菌之一，已经被证实是刺参弧菌病的主要致病菌。近年来由哈维氏弧菌造成的水产动物病害也频频出现。目前，控制水产动物弧菌病的主要手段是抗菌药物治疗(链霉素、氯霉素、强力霉素)。面对日益严重的耐药毒株的出现，利用抗生素来防止细菌污染已经不是最佳防控方法。耐药毒株会在环境中进化并产生，抗生素的开发远不及耐药毒株出现的速度。因此，由细菌污染食品引起的中毒检测表明，导致疾病产生的源头来自于抗生素滥用所产生的耐药细菌。

噬菌体是病毒的一种，其特别之处是专以细菌为宿主。噬菌体是一种普遍存在的生物体，而且经常都伴随着细菌。通常在一些充满细菌群落的地方，如：泥土、动物的内脏里，都可以找到噬菌体的踪影。目前世上蕴含最丰富噬菌体的地方就是海水。在海平面，平均每毫升的海水即含有10⁹个病毒粒子(virions)，并使海水中70％的细菌受到噬菌体的感染。裂解性噬菌体感染细菌后，可在宿主菌内快速增殖，并使之裂解，故又称毒性噬菌体。哈维氏弧菌噬菌体可以特异性感染并裂解哈维氏弧菌，因而具有杀菌作用。在感染模型中，噬菌体能够特异杀死哈维氏弧菌；而在水产生产中，噬菌体能够作为抗菌剂来控制细菌污染， 具有潜在的开发价值。

发明内容

本发明要解决的技术问题是针对目前人们在防止哈维氏弧菌(Vibrioharveyi)引起的刺参腐皮综合症时，使用抗生素容易导致细菌耐药性的产生，提供一种新的能够特异性裂解哈维氏弧菌的噬菌体及其应用。

本发明的目的是这样实现的：

通过特异性弧菌培养基以及回接感染试验筛选致病性弧菌，对具有致病性的弧菌进行生理生化以及分子生物学鉴定。鉴定该菌株为哈维氏弧菌(Vibrioharveyi)，利用分离得到的病原菌进行噬菌体的分离，对分离得到的两株不同大小噬菌斑的噬菌体进行透射电镜扫描，抑菌试验。通过试验可以得出分离得到的两株噬菌体对哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)具有强烈的裂解作用。

本发明的效果和益处是：

(1)专一性裂解目标病原微生物，不会破坏水环境中的正常菌群。传统的抗生素治疗在杀灭致病菌的同时，也破坏了水体中正常的浮游微生物，引起微生态失衡，并导致机会性感染；

(2)噬菌体是宿主依赖性的，只在细菌感染部位发生作用，随着宿主菌的清除而消亡，不会残留在动物体内；

(3)噬菌体能够自我复制增殖，可保持长期持续作用，且其感染发生在水溶液状态中；

(4)安全无毒副作用，噬菌体由蛋白质和核酸组成，降解后的终产物是氨基酸和核酸片段，对人和动物安全。

附图说明

图1是分离得到两种哈维氏弧菌噬菌体示意图。

图2是两种哈维氏弧菌噬菌体的体外抑菌示意图。

具体实施方式

以下结合技术方案详细叙述本发明的实施例。

实施例1、哈维氏弧菌噬菌体分离制备

本发明样品采自刺参养殖厂的养殖污水，经双层滤纸过滤，8000rpm，离心20min，再用0.22μm滤膜过滤上清。取50ml滤液，加入2ml噬菌体宿主菌过夜培养物，再加入CaCl₂母液(已过0.22μm滤膜除菌)至终浓度1mM混匀后，加入Zobell2216E培养基，室温作用1h，再放置于37℃培养24h。取上述培养物以10000rpm离心10min，取上清，再用0.22μm滤膜过滤，滤液形成噬菌体原液。取噬菌体原液0.1ml，进行10倍梯度稀释，取10²、10⁴、10⁶、10⁸稀释液各0.1ml与对数生长期的哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)1ml混合，室温作用15min后，加入10ml 0.7％的2216固体培养基，混匀后迅速倾倒入2216E培养基平板上层，摇匀平置5min，待其凝固，置于28℃温箱培养12h后观察，获得形成噬菌斑的双层平板。

实施例2、噬菌体的纯化培养和浓缩