[发明专利]一种制备重组人源铜锌超氧化物歧化酶的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种制备重组人源铜锌超氧化物歧化酶的方法，更具体地涉及通过基因工程方法来制备重组人源铜锌超氧化物歧化酶。

背景技术

超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，简称SOD)是一类广泛存在于生物体内的抗氧化金属酶类，其主要功能是特异性地清除体内过量的强氧化性物质-超氧阴离子自由基，解除其对细胞的毒害作用。SOD现已被用于治疗氧中毒、老年性白内障、糖尿病、心血管疾病、炎症等多种疾病；用于辅助放疗、化疗以及器官的保护、移植；加入化妆品中用于防晒、防皮肤衰老和脂褐质的形成；以及用作食品工业中的添加剂。

根据其活性中心结合的金属离子的不同，SOD主要分为三类：铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD，也称为SOD1)、铁超氧化物歧化酶(Fe-SOD)和锰超氧化物歧化酶(Mn-SOD)。其中，Fe-SOD主要存在于原核细胞的基质中，Mn-SOD主要存在于原核细胞和真核细胞的线粒体中，而Cu/Zn-SOD则主要存在于包括人类在内的真核生物细胞的细胞质中。

最初，SOD主要从动物或植物中提取。动物来源的SOD主要从牛血、猪血中提取，但上世纪末疯牛病的爆发使得欧盟于1997年开始禁止食品、化妆品、医疗等领域使用从动物血液和组织中提取的SOD。鉴于不断爆发的动物流感及人畜混杂流感，为了减少交叉感染的潜在危险、保护人类的健康，全球范围内禁止使用包括SOD在内的动物来源生物制剂必将成为一个大趋势。在这个大趋势下，植物或微生物来源的SOD开始受到人类的青睐。从植物或微生物中提取的SOD对于人类不存在交叉感染的潜在危险，但是它们具有比动物来源的SOD更大的异源性，临床应用可能会带来免疫反应等安全性问题，这就限制了它们在临床上的应用。

随着基因工程技术的发展，人们开始尝试采用基因工程技术来生产SOD，特别是生产人源铜锌超氧化物歧化酶(hSOD1)以克服异源性的问题。目前通过基因工程技术生产hSOD1的方法主要是将hSOD1的编码基因连接到含有纯化标签序列的表达载体中以获得重组载体，之后将重组载体转化到合适的表达菌株中，以表达带有纯化标签的重组人源铜锌超氧化物歧化酶(rhSOD1)，并利用纯化标签对rhSOD1进行纯化。随后，还需要将纯化标签切除。

但是，以上方法仍然存在很多问题，主要包括：(1)目的蛋白的比活力不高，一般不高于4000U/mg；(2)目的蛋白的表达量不高，即重组菌株表达出的带有纯化标签的rhSOD1占菌体总蛋白的比率很低；(3)纯化过程复杂，即带有纯化标签的rhSOD1主要存在于菌体破碎后的沉淀中，因此需要对rhSOD1进行繁琐的变性、复性、纯化等一系列工艺才能获得活性形式的rhSOD1；(4)不适于工业化，即rhSOD1所带有的纯化标签有助于后续的纯化操作，但考虑到蛋白活性问题通常需要在蛋白纯化后将这些纯化标签切除，导致工业化生产的工艺繁琐、成本增加和不必要的产物损失；和(5)现有技术中从未提及纯化后rhSOD1中的内毒素问题。

鉴于hSOD1的重要性，人们十分需要一种表达量高、纯化简便并适于工业化的hSOD1生产方法，且此方法生产出的hSOD1具有高比活力和低内毒素。

发明内容

本发明的目的是提供一种制备rhSOD1的方法，所述方法目的蛋白表达量高，且表达菌株表达出的rhSOD1绝大部分存在于菌体破碎后的上清液中，非常易于纯化获得高纯度的rhSOD1。同时，本发明的另一个目的是提供一种提高rhSOD1比活力的方法，所述方法包括向纯化后的rhSOD1同时加入铜离子和锌离子。

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种制备高表达的rhSOD1的方法，所述方法包括：

(1)将包含hSOD1基因编码序列SEQ ID NO 1的核苷酸片段插入原始载体中，以构建重组载体；

(2)将重组载体导入表达菌株，得到重组菌株；

(3)将重组菌株扩大培养；

(4)将菌体破碎，离心得到上清液；和

(5)将上清液纯化，得到纯化后的rhSOD1。

根据本发明的另一个方面，本发明提供了一种提高rhSOD1比活力的方法，包括向纯化后的rhSOD1中同时加入铜离子和锌离子。

在一个实施方式中，向纯化后的rhSOD1中同时加入至少0.2倍rhSOD1蛋白摩尔数的铜离子和至少0.2倍rhSOD1蛋白摩尔数的锌离子，优选铜或锌离子的添加量为rhSOD1蛋白摩尔数的1至10倍，更优选铜或锌离子的添加量为rhSOD1蛋白摩尔数的10倍，优选所述铜离子和锌离子的终浓度相同。