[发明专利]猪气管上皮细胞系及其建立方法

权利要求书

1.一种猪气管上皮细胞系的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)原代培养：无菌获取初生仔猪气管，清除粘附组织，采用链酶蛋白酶灌注冷消化法消化分离获得高纯度的气管上皮细胞；将分离得到的原代气管上皮细胞悬浮于DF12培养基中，置于37℃，5％CO₂条件下培养；

(2)转染和筛选：提取纯化含有hTERT基因的真核表达质粒pCI-neo-hTERT，采用脂质体转染法，将编码hTERT和neo基因的真核表达质粒pCI-neo-hTERT导入步骤(1)原代培养的猪气管上皮细胞进行转染；

(3)筛选和扩大培养。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)将pCI-neo-hTERT质粒转染原代培养的猪气管上皮细胞，其具体步骤如下：

(1)转染前24h，将STECs用蔗糖EDTA和0.25％胰酶分步消化成单个细胞，以1×10⁵个细胞/孔接种到12孔板内，使细胞在转染当天能达到80％～90％的融合；

(2)转染前4h更换无血清的DMEM/F12；

(3)用无血清的DMEM/F12稀释5μL pCI-neo-hTERT质粒至体积为50μL，轻轻混匀，质粒浓度达到300ng/μL～400ng/μL室温作用5min；

(4)用无血清的DMEM/F12分别稀释Lipofectamine 2000 6μL、9μL、12μL到50μL，轻轻混匀，室温作用5min；

(5)混合稀释的质粒和稀释的Lipofectamine 2000，此时总体积为100μL。轻轻混匀，室温作用20min；

(6)将12孔板中的旧培养液吸出，用D-Hank’s清洗，加入900μL无血清的DMEM/F12；

(7)逐滴加入脂质体/DNA混合物到不同孔中，边加边前后来回摇动培养板，轻轻混匀；同时设立2孔未转染作为空白对照；

(8)在37℃、体积分数比为5％CO₂饱和湿度培养箱中孵育4～6h，弃去培养液，加入完全的DMEM/F12培养基；

(9)24h～48h观察细胞，并及时换液。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)的具体操作为：

(1)转染48h后待细胞汇合至80％时，将细胞传代消化到另一个12孔板中，然后加入800μg/mL G418进行筛选，第7天时，可用胰酶于原皿消化细胞，弃去消化液并补加筛选液，连续培养两周，每两天换相同浓度G418筛选液1次，每天观察细胞生长及死亡情况；

(2)待对照孔的细胞全部死亡后，将G418的浓度减半，降至400μg/mL；

(3)继续筛选细胞一个月左右，每两天换1次液，直到阳性克隆可见为止；

(4)将阳性克隆用滤纸片法消化并转移至新12孔板，扩大培养。

4.根据权利要求1所述的方法建立的猪气管上皮细胞系。